本文是一篇中医论文，在课题组前期的临床研究中，通过临床验证、审证求因等多个层面的分析探讨，也验证了肾虚是 BPH 发病的基本条件，血瘀则是其病理改变的重点环节。
引 言
随着现代人类生活方式的改变以及全球人口老龄化的严峻形式，前列腺相关疾病是困扰全球中老年男性的首要健康问题之一，这其中包括前列腺炎、良性前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia, BPH)，以及前列腺癌(prostate cancer, PCa)等前列腺健康问题[ 1 ]。前列腺的亚健康人群也非常广泛，其年轻化趋势更加明显，这对男性生活质量的影响也非常明显，因此对于前列腺健康问题的预防与治疗研究也成为当下男性健康问题研究的热点。在中医理论中，此类疾病与“癃闭”有一定的相关性。“癃闭”一词最早见于《黄帝内经》中，伴随着中医药历史的发展，对于此病的诊治方案也沉淀出了许多行之有效的临床经验。我国历代医家都对“癃闭”进行过深入辨证、处方研究，也沉淀出许多行之有效的方药，但就此类疾病的病因并未被彻底阐明。在关于 BPH 病因病机的前期研究中，我们发现肾虚血瘀证是 BPH 最为多见的病机形式，动物实验过程中初步发现补肾活血方对 BPH相关病理表现有一定的改善，而在加入一些具有抗炎抗氧化作用的中药后效果更佳。历年来西方医学也提出过多种 BPH 的病因假说，而氧化应激反应、炎症更成了近年来前列腺炎及 BPH 病因病机研究的热点。机体的氧化还原反应参与了体内多种生理、病理进程，研究表明氧化应激对前列腺相关疾病的发生与发展过程有一定的影响[ 2 -4 ]。氧化应激环境活化炎症因子，造成组织炎性浸润，导致细胞代偿性的增殖，在关于 BPH 和 PCa 的组织学研究中，发现有超过 92%的炎性病变发生率[ 5 ]。另一组织病理学调查证实，在 BPH组织的周边区域，即其与正常前列腺组织的过渡区域的炎症因子较正常组织更为聚集[ 6 ]。因此对抗体内异常的氧化应激环境将会是未来预防此类疾病的重要策略，也是解决前列腺亚健康状态的应对方式。但到目前为止，许多在动物实验中被证实有一定疗效的抗氧化剂，在临床疗效的表现上却不尽如人意。鉴于体内造成氧化应激损伤的途径具有多样性，且外源性抗氧化剂在疗效上存在诸多缺陷，因此，能应对多类型氧化应激反应的内源性抗氧化信号通路将会是防治 BPH 的一种新策略。
Nrf2 信号通路是体内抗氧化应激反应极为重要的内源性信号通路，其核心转导分子包括核因子 E2相关因子 2（nuclear erythroid-2 related factor2,Nrf2）、抗氧化反应元件（ antioxidant response element, ARE ）和 Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白 1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）[ 7 ]。Nrf2 信号通路在体内诱导多类生物转化酶、解毒酶，促进体内外排转运体的表达，加速体内毒物外排且增加机体抗氧化能力，是体内细胞保持氧化还原反应平衡状态的关键信号传导机制[ 8 -9 ]。Nrf2 信号通路在前列腺相关疾病的氧化应激损伤过程中扮演着重要的保护角色[ 1 0 ]，其对前列腺亚健康状态的调整及对前列腺炎、BPH 等疾病进程中的保护机制，势必将成为学者们关注的热点。血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）和醌氧化还原酶 1（NAD(P)Hquinine oxidoreductases 1, NQO1 ）是 Nrf2/ARE 通路下游重要的抗氧化因子，活化 Nrf2 信号通路能增加 HO-1、NQO1 等相关因子的表达，从而对抗细胞、组织的氧化应激[ 11 - 1 4 ]。HO-1 是多种疾病防治研究过程中的重要靶点，NQO1 是体内一种重要的Ⅱ相反应酶，并维持体内细胞池中抗氧化剂含量，如维生素 E 等[ 1 5 ]。HO-1、NQO1 参与外源性物质代谢过程，在细胞的保护、转化和凋亡过程中发挥重要作用[ 1 6 -1 9 ]。活性氧（reactive oxygenspecies , ROS）是组织炎症的标志，往往反应了机体内氧化应激水平，ROS还参与了机体前列腺炎及 BPH 的发生和发展，引起前列腺组织的变性、缺氧、水肿、纤维化、瘀血等病理变化[ 2 0 - 2 3 ]。谷胱甘肽（glutathione , GSH）在机体内具有整合解毒和抗氧化等多重功效，是一类含有巯基的小分子肽类物质[ 2 4 ]，因此 GSH 水平常在相关实验中作为机体抗氧化能力的反应。
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第一章 克癃胶囊对 H2O2诱导氧化应激损伤的保护作用
克癃胶囊是在的 BPH 临床研究成果及中医对其病因病机认识的基础上，结合 BPH 的现代药理学研究，在传统中医古方金匮肾气丸的基础上化裁、组方所成，其方中含有四种具有抗炎抗氧化活性的药物，即桂枝、黄芪、南瓜子油和大豆异黄酮。在前期的临床相关实验研究中，克癃胶囊在治疗 BPH 的疗效上有着显著表现。本研究所选用的 PC-3 细胞株来源于人的前列腺癌组织，是一种广泛应用于药理学和前列腺相关疾病研究的细胞种类。参考近年来国内外的文献报道，许多关于前列腺疾病的抗氧化应激研究也选用这一细胞模型进行实验[ 3 0 -3 1 ]。本项研究主要考察克癃方对 Nrf2 信号通路及其抗氧化应激相关因子表达的影响，且设置了正常对照组，故选用 PC-3 细胞株对实验结果无影响，符合研究目标。叔丁基对苯二酚(Tert-butyl hydroquinone, tBHQ)是目前已被证实的是对细胞的氧化应激反应具有保护作用的小分子 Nrf2 信号通路诱导剂，在本项实验研究中 tBHQ 作为阳性对照药物参与实验研究。H2O2是科学研究中常用的组织、细胞氧化应激造模药物，其作用效果稳定，近年来也被用于前列腺组织的氧化应激研究，本实验也采用这一药物进行造模研究。
1 细胞培养
前列腺癌（PC-3）细胞株，购自于中山大学细胞库。将细胞冻存管从-80℃冰箱内取出，将瓶身迅速置于 37℃水中，轻轻的不断摇晃，使其尽快融化；将其内细胞混悬液吸到提前消毒好的离心管中，加入 4 ml 培养液；800 rpm 离心 5 min，弃上清液；在离心沉淀内加适量的完全培养液后，吹匀，将细胞混悬液置于提前紫外消毒好的培养瓶中，在 37 ℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。隔日对细胞进行换液操作，当细胞的融合密度至 80%-90%时，即可传代。吸去瓶内培养液，取 3 ml PBS 冲洗，重复一次；加入 1ml 胰蛋白酶，轻轻晃动培养瓶，利用显微镜查看瓶底细胞的形态，当细胞开始回缩变圆，相互之间间隙变大时，立即加入培养液 3 ml，轻柔地将瓶底细胞吹打下来，终止消化；800 rpm 离心 5 min，弃上清液；加入 3 ml 培养液，吹散，将细胞混悬液均匀分至 2-3 个培养瓶中，每瓶补充适量的培养液。
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1.2 药物制备
克癃方组成：熟地 100 g，山萸肉 25 g，丹皮 125 g，茯苓 125 g，炙附子 50 g，生黄芪 50 g，桂枝 125 g，磁石 16 g，40 %大豆异黄酮 14 g，南瓜子油 10 g，中药材购于湖南中医药大学第一附属医院中药房，40 %大豆异黄酮、南瓜子油购于北京索莱宝科技有限公司。本实验所采用的克癃方药物是经水提法提取而成的中药复方提取物，原药材所得的提取液经真空减压干燥成干浸膏后，再打碎成粉而得，药物提取制作过程由湖南中医药大学药学院天然药物化学实验室完成。精密称取在 70℃条件下真空干燥至恒重的克癃方提取物 10 mg,置于1.5 ml 离心管中，用移液器吸取 1 ml DMSO 溶液加入离心管中，溶解至刻度，轻轻混匀，即制得浓度为 10 mg/ml 的药物母液。经 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱避光储存备用。待实验时再稀释至相应浓度，该供试品溶液中 DMSO 体积比低于 0.1 %，符合细胞试验过程中溶液内 DMSO 含量要求。H2O2的则由去离子水经 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后稀释至各实验所需浓度。而根据相关参考文献的实验方法[ 3 2 - 3 3 ]，阳性对照组药物 tBHQ的作用浓度为 50 μmol/L。本课题为国家自然科学基金项目的前期体外研究，选择克癃方提取物供试品溶液作为研究对象用于细胞实验以获得初步结果；课题组后续将进行体内动物实验，计划收集克癃方含药血清作为研究对象作用于细胞，对前期结果进行对照和验证。
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第二章NRF2介导克癃胶囊对细胞氧化应激损伤的保护机制....14
1材料与方法.............14
1.1实验试剂与仪器........14
1.2细胞培养..........15
1.3药物配制..........15
1.4实验分组..........15
2实验设计与操作............15
2.1Westernblot法检测蛋白表达.....15
2.2Q-PCR检测相关基因的表达........17
2.3统计学分析......21
3结果..........21
3.1克癃方预处理对PC-3细胞Nrf2及相关因子蛋白表达量的影响....21
3.2克癃方预处理对PC-3细胞Nrf2及相关因子mRNA表达的影响...22
4本章小节.............24
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讨论....25
讨 论
在中医学对 BPH 的认识中，肾气亏虚、年老体衰之人是该病主要的发病人群，而其在人体的基本病理基础常为湿热、痰浊、血瘀等，当这些发病基础遇之外感六淫、劳力过度、情志刺激等发病诱因时，BPH 就在人体上发生了。在课题组前期的临床研究中，通过临床验证、审证求因等多个层面的分析探讨，也验证了肾虚是 BPH 发病的基本条件，血瘀则是其病理改变的重点环节，两者之间相互作用则正是 BPH 的病理机制。鉴于其病机的特点，补肾活血法常用于 BPH 的中医治疗中。在亚健康领域，“抗氧化”成为了近年来的科学研究和产品研发的热点。对抗体内异常的氧化应激环境，也逐渐成为了各类疾病预防与治疗研究的重要方向。有研究表明 BPH 患者的前列腺组织是处于氧化应激状态的，并且认为正是此种内环境促进了前列腺局部组织的增生、重塑。鉴于前列腺健康问题与氧化应激反应密切的相关性，针对 Nrf2 信号通路介导的抗炎、抗氧化、解毒机制的研究为 BPH 的预防与治疗提供了一种新的思路[ 3 8 -3 9 ]。中医治“未病”的概念近年来也不断扩展开来，其内涵已包括了疾病的无病期、欲病期、“既病防变”期、愈后防复期，由此可见，中医治“未病”的内涵决不仅仅是指无病期而已。这一概念与现代亚健康疾病防治理论不谋而合。作为前列腺疾病的重要影响因素，氧化应激状态对前列腺疾病的形成与发展均有很大的影响，因而对抗氧化应激也将成为 BPH 预防与治疗的主要方法之一。当人体受一些外界不良因素影响时，机体内氧自由基形成与清除的平衡就可能会遭到破坏，ROS 生成过多而体内活性酶的清除能力下降，使得机体处于氧化应激环境之中[ 4 0 -4 2 ]。BPH 患者的前列腺组织中也存在氧自由基增多，ROS 水平升高，氧化应激作用增强的表现[ 4 3 - 4 7 ]。GSH 在保护细胞对抗氧化应激损伤及保持正常的细胞循环方面所发挥着关键作用，使得其被普遍认为是细胞重要的保护成分之一，其细胞中含量也常作为组织抗氧化应激水平高低的标志[ 4 8 -4 9 ]。因此本文第一章内容中，针对克癃胶囊是否具备氧化应激损伤的保护作用的研究，选择以细胞内 ROS、GSH 水平为考察指标。
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结论
1 克癃胶囊对 H2O2所致的 PC-3 细胞氧化应激损伤具有保护作用。
2 克癃胶囊的上述保护作用的机制可能与其激活 Nrf2 信号通路，上调 Nrf2及其相关因子 HO-1、NQO1 的表达有关。
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参考文献（略）
