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柴胡三参胶囊对BMSCs分化为心肌细胞过程中PI3-K/Akt信号通路的中医干预

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  • 论文编号:el2018060218363017090
  • 日期:2018-05-31
  • 来源:上海论文网
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本文是一篇中医论文,中医学属于在阴阳五行理论指导下、从动态整体角度研究人体生理病理药理及其与自然环境关系、寻求防治疾病最有效方法的学问。(以上内容来自百度百科)今天为大家推荐一篇中医论文,供大家参考。
 
引言
 
心血管病已是侵害人类身体健康的主要疾病之一,2010 年全国疾病监测系统统计的数据揭示农村及城市心血管病死亡人数所占比例分别为 19.1%、22.3%[1],均位居前列。而心律失常乃心血管病极度普遍的临床表现类型,尤以 VT、VF 等急性缺血相关性心律失常尤为严重,不光使基础心脏疾患恶化,还能引发猝死[2],极难预料,临床风险重大。其病因多端,病机复杂,多由缺血性心脏病引发,可导致血流动力学异常,引发和加剧心功能不全,严重者可发展为心衰甚至导致休克。且最近一段时间国内该病患病率及因并发症致死病例上升明显[3]。而欧美年均 39 万人因 MA 丧命[4],其中缺血性心脏病是诱发 VT、VF 等 MA的首要原因,约莫占 VT 和 VF 发生率的 65%[5]。当前药物治疗依旧是心律失常的第一位治疗措施。最近对心律失常治疗有了进一步共识,即药物选择主要注重其效应性,对其防治着重观察药物的可靠性,主要目的为消除其引起的恶果,而不是把医治心律失常本身作为重点。指南中指出应以控制原发病为重点,调控心脏基本状况,如保证充足血供、稳定血流动力学状况等比医治心律失常自身更为紧要。此外,药物研究逐渐由组织器官水平向细胞水平发展,干细胞移植治疗心肌缺血及由此诱发的心律失常得到了越来越多的关注与研究,这与中医药通过整体观念和辨证论治思想考虑疾病的病因病机,调整人体气血阴阳,调和机体脏腑的生理状态,治病求本,和其不和,使之平衡相一致。
导师根据其师程丑夫教授多年防治心律失常的临床经验,并通过一系列实验研究证实柴胡三参胶囊抗心律失常效果明显[6-9],且在前期研究中发现,其能够明显减少缺血性心律失常大鼠心肌中 PKA、PKC 的表达及血清 CRP 水平,表明其对心肌急性损伤具有保护作用[10],此外,其还能明显的减少大鼠心肌细胞 HERG K+通道蛋白的失活,减少快速型室性心律失常的出现[11]。本课题来源于 2013 年湖南省重点实验室开放基金计划项目,编号:2014XNFZ03,名称:柴胡三参胶囊对缺血性心律失常干细胞微环境调控的研究。通过对柴胡三参胶囊促进BMSCs 分化为心肌细胞后 Akt、GATA-4 及β-MHC 表达程度影响的研究,佐证柴胡三参胶囊能够通过促进诱导剂与受体结合激活 PI3-K/Akt 信号通路促进 BMSCs 向心肌细胞的分化,为柴胡三参胶囊的临床运用提供理论依据并为进一步研究拓宽思路。
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第一部分 材料与方法
 
1.实验材料
1.1 实验对象
P1代骨髓间充质干细胞株,于赢润生物科技有限公司购入。
 
1.2 药物与试剂
 
1.2.1 药物
柴胡三参胶囊(CHSSC),组成:柴胡、党参、法夏、黄连、苦参、丹参、青蒿、炙甘草。由湖南中医药大学第一附属医院药剂室制作,批号:681210;
 
1.2.2 主要化学试剂
特级胎牛血清,青霉素,链霉素,DMEM/F12 培养基,水合氯醛,PBS 粉,DMSO 溶解剂,MTT 试剂盒,逆转录试剂盒,相应引物,DNAmarkerⅠ,BMP-2 粉末包(2μg),0.25%胰酶+0.02%EDTA,Trizol 试剂,细胞蛋白裂解液,二抗,兔抗鼠 Akt(Thr308)抗体,抗体 GATA-4,抗体β-MHC。
 
1.3 主要仪器
超净工作台,低速离心机,低温冰箱(-86℃、-20℃),恒温水浴箱,紫外分析仪,低温液氮罐,电泳仪,PCR 扩增仪,VDS 凝胶成像系统,相应细胞培养装置及器皿,Milli-QAdvantage 纯水器,可调式微量移液器系列,显微镜,电子天平,离心管,EP 管,封口膜,tips 头,牛皮纸,注射器,0.22μm 微孔滤膜,灌胃针,手术器械系列,真空采血针、管,医用脱脂棉,橡胶手套等。
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2.实验方法
 
2.1 实验分组
根据不同处理因素将 BMSCs 分为 4 组:BMP-2 组、BMP-2+含药血清组(合药组)、含药血清组及空白血清组,分别加入 BMP-2 溶液、含药血清+BMP-2 溶液及含药血清、空白血清。
 
2.2 血清制备
标准 SD 大鼠 20 只,重约 200±20g,雌雄对半(购自天勤公司),许可证号:SYXK(湘)2015-0003。条件均符合本实验要求,喂养过程中给水充分,以普通饲料喂养,定期更换垫料清洗鼠笼,大鼠自由摄食。实验均在动物伦理学指导下进行。依据《药理实验方法学》[12],将大鼠随机分为柴胡三参胶囊组和空白组,每组 10 只,每日定于 8Am 和4Pm 依次灌服柴胡三参胶囊灌胃液及等量生理盐水,采取 3 倍量给药,持续 7d,3 倍量依据成人 70kg、大鼠 200g 体表面积换算,公式:D2=D1×R2÷R1,每天给药量为 48mg,分2 次灌服。末次给药 1h 后,水合氯醛进行腹腔麻醉,无菌前提下取腹主动脉血,后即刻注入真空采血管,标准环境中静放 2h,当上清析出后,低速分离 10min,所得上清液即含药血清,本组血清汇合后于 56℃水浴中灭活 40min,0.22μm 微孔滤膜除菌,每组各 3 管,每管 7ml,做好标记,于低温冰箱内存放。
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第三部分 讨论............. 9
1.西医学对缺血性心律失常的认识及研究.............. 9
1.1 缺血性心律失常与骨髓间充质干细胞...... 9
1.2 骨髓间充质干细胞与 PI3-K/Akt 信号传导通路................10
2.中医学对缺血性心律失常的认识与研究.............11
2.1 病因病机..............11
2.2 和法在心律失常中的应用........... 12
2.3 柴胡三参胶囊的组方特点及研究进展.... 13
3.柴胡三参胶囊对 PI3-K/Akt 信号通路中 Akt 蛋白表达...... 13
第四部分 结论........... 15
 
第三部分 讨论
 
1.西医学对缺血性心律失常的认识及研究
缺血性心律失常是心肌缺血导致心肌细胞坏死抑或凋亡,无法达到心肌修复要求进而出现其数量减少,导致电活动形成及传导均反常。缺血引发心脏中拥有正常舒缩效应的心肌细胞数目下降,心功能减退。以往的观念表明心脏不具有再生以及自我修复的功能,也无法进行自我更新,只能依靠纤维瘢痕组织修复或未受损心肌细胞肥大来进行代偿[13],这必将进展成充血性心力衰竭。所以,保证足量拥有正常舒缩功能的心肌细胞是改善心肌受损的重中之重。当前的治疗手段固然能够对病程进展有所缓解,然而却无法逆转己丧失正常功能的心肌,疗效甚微。利用移植干细胞的方法来治疗缺血性心律失常是当前研究热点,尽管仍未完全投于临床,却为基本治愈缺血性心肌病指明了一条方向[14]。干细胞属于多潜能细胞,它拥有自我复制功能,在相应诱导剂的作用下能够分化为拥有其他功能的细胞。研究指出[15]对终末期心衰病人心肌细胞观察中找到了仍在进行分裂增殖的细胞,在损伤心肌中均观察到某些正在分裂为具有心肌细胞特征的细胞[16-17]。随后在对许多动物如小鼠、大鼠、狗等的观察中也找到相似细胞,这类细胞能够自我更新复制、定向分化,而且可以分化为心肌细胞[18],被定义为干细胞的一种。当中发现最早并且探讨最广泛的是成体干细胞中的 BMSCs[19]。此类细胞是从骨髓中筛选的已提交心肌谱系的多能成体干细胞,在某些诱导剂作用下可分化成心肌细胞,延缓心脏重构,保证细胞的正常功能,促进损伤心肌的修复[20],这无疑在心律失常的治疗中拥有重要的运用前景。此外,BMSCs 容易取材,对人体损害甚微,而且可以进行定向分化,并且方便着床,缺血条件对其无明显影响,自身细胞移植也未见明显排异现象等。以上特性使 BMSCs 移植具有天然优势。干细胞的研究使得心脏也拥有再生效应和自我修复功能,就如同肝脏,脑组织一般。在缺血性心肌大鼠模型中,将 BMSCs 在体外增殖成熟后,采用先进技术使其着床于缺血组织中,此时,其处于分化高峰期,因其特性不会受外在因素影响,则即时启动分化效应,分化为心肌细胞,保证因缺血而受损心肌细胞的数目,这样拥有正常舒缩能力的心肌细胞数量将会增加,已丧失掉的部分心脏功能也可以得到部分补充,这无疑对于缺血性心律失常的治疗十分有益。
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结论
 
本实验通过进行增殖实验,确定最佳浓度及最佳时间;添加 BMP-2 及备用血清,分为BMP-2 组、BMP-2+含药血清组、含药血清组及空白血清组,比较观察各组干预后 Akt 蛋白、GATA-4、β-MHC mRNA 表达水平的结果表明:1、骨髓间充质干细胞增殖定量分析证实,柴胡三参胶囊能够促进骨髓间充质干细胞的增殖。2、柴胡三参胶囊能够增加 Akt 蛋白的表达,Akt 是全传导链中关键性的承上启下的一环,可见其可以促进诱导剂与受体结合通过 PI3-K/Akt 信号通道促进骨髓间充质干细胞分化。3、柴胡三参胶囊能够增加 GATA-4、β-MHC mRNA 表达,说明其可以促进骨髓间充质干细胞定向分化为心肌细胞。#p#分页标题#e#
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参考文献(略)
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