药学论文哪里有？本文构建的ROS响应型角蛋白纳米粒展现出良好的血肿靶向释药、特异性保护神经元及促进神经功能恢复的作用，在脑出血药物递送系统上有突破，对补充ICH的临床治疗途径，提高ICH神经功能预后具有非常积极的作用。
1 绪论
1.2 科学问题的提出及研究意义
血肿直接影响脑出血预后，是ICH治疗的核心。促进脑内小胶质细胞/巨噬细胞表达的清道夫受体CD163高表达可促进内源性血肿吸收，但神经元的CD163高表达会诱导其凋亡，影响了ICH的治疗效果。因此，如何在ICH后促进内源性血肿吸收治疗的同时特异保护神经元是本论文要研究的科学问题。
基于上述问题，本文基于ICH后血肿区域的异常ROS浓度，利用FBD的血肿靶向、NBC的ROS响应、C3肽的神经元靶向以及sCD163与Hb-Hp亲和性，通过制备载Bex/sCD163-Fc-C3的FBD-sK37-2α-NBC (FKNBs)，在血肿区域靶向释放Bex促进血肿吸收，并且sCD163-Fc-C3在神经元附近清除Hb-Hp，以实现促进血肿吸收和神经元保护的双重功能（图 1.6）。
3 FKNBs体外生物活性及毒性评价
3.3 实验方法
3.3.1 主要试剂的配制
① 细胞培养基：移取10 mL FBS，1 mL双抗，90 mL DMEM培养基，混匀，储存于4℃冰箱中待用。
② 冻存培养液：移取1 mL DMSO，2 mL FBS，7 mL DMEM培养基，混匀，暂存于4℃冰箱中。
③ 0.1 M碳酸氢钠溶液（p H=8.5）：称取8.41 g碳酸氢钠，溶于1L去离子水中，溶解充分，调节pH=8.5，室温保存待用。
3.3.2 载药率和包封率考察
① 检测波长的确定
首先要确定蓓萨罗丁的紫外最大吸收波长，使用紫外分光光度计对Bex进行全坡长扫描（200~600 nm）。精密称取10 mg Bex，用甲醇溶解并且定容至100 mL，配制成100 μg·mL-1用0.22 μm的滤头滤过，用作母液。配制低浓度溶液（30 μg/mL），置于紫外分光光度计中全波长扫描，测定紫外可见光谱 (Ultraviolet-visible spectroscopy, UV-Vis)，得到最大吸收波长λmax。
② 标准曲线的建立
精密移取一定量的Bex母液（100 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，加入去离子水，将母液稀释至刻度线，分别得到的80、60、45、30、15、8、4、2 μg/mL的Bex对照品，分别测定这些浓度的Bex在260 nm处的吸收值，以吸收值Abs为纵坐标，浓度C(μg·mL-1)为横坐标，制作标准曲线图，得出回归方程公式。
4 FKNBs体内生物活性与毒性评价
4.1 引言
在进入临床前纳米粒除考察体外生物活性、稳定性及毒性外，还应进行动物活体实验的考察与验证，进一步评价治疗效果及生物安全性。具体包括ICH大鼠体内靶向性评价、促血肿吸收评价、神经元保护评价、神经行为学评价、急性毒性评价以及组织相容性考察。
本章构建的ICH模型是采用向SD大鼠右侧尾状核注射自体全血的方法。用FITC标记sCD163-Fc-C3上，再加载到纳米粒中，经尾静脉注射到ICH大鼠体内，通过脑组织切片荧光成像观察并评价FITC-sCD163-Fc-C3在血肿周围神经元靶向性；对ICH建模的大鼠定期给药，分别在第1、3及5天取脑组织，将脑组织均匀切成1 mm冠状脑片，观察血肿吸收进展；测定脑出血给药后血肿周围CD163的表达情况，从受体表达水平进一步验证Bex促血肿吸收的作用；利用TUNEL染色评价ICH给药后神经元的存活情况；并对ICH大鼠给药后神经行为学进行评价，包括Longa评分、转角实验（Corner test）、前肢上抬实验（Forelimb placing test）及旷场实验（Open field test）；定期观察动物术后生理状态、体重变化、脏器系数来考察纳米粒的急性毒性作用；最后将主要脏器取出，通过组织切片H&E染色观察评价纳米粒的组织相容性。
4.2 实验材料与仪器
4.2.1 主要试剂的配制
将SD大鼠饲养于清洁无尘、通风的环境中，且温度在25℃左右、空气湿度在40%~70%之间，自由饮食，给予无菌水，光照时间12 h，明暗交替。
首先，记录实验前大鼠重量，对手术器械进行消毒，腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg），将麻醉后大鼠放置于恒温加热毯上进行试验，避免实验过程中动物失温。调整立体定位仪的耳杆固定头部，剃除头部的毛发，沿中线剪开大鼠头部皮肤约1.5 cm，分离皮下组织，将额顶骨暴露，用棉签擦拭找到囟门位置，标记好右侧尾状核对应位置，即囟门右侧3.5 mm，前方0.2 mm处；其次，利用微型颅骨钻在颅骨表面钻出一个1 mm的小孔。将大鼠从立体定位仪取下，左手食指与拇指轻按眼眶处皮肤，使眼球突出，从眼球与眼睑之间插入毛细采样管，轻轻旋转，直到血流速度较快即可收集血液，取血完成后，用棉签按压大鼠出血处止血；再次，将大鼠固定在立体定位仪上，用26号针头取适量新鲜的自体血，固定在立体定位仪上，旋转立体定位仪的旋钮将注射器调整至小孔的竖直上方，沿孔匀速进针穿刺右脑尾状核（腹侧深度5.5 cm），将血液在1 min内匀速注射进右脑尾状核中，并静置留针10 min左右，待血液凝固不再返流时，匀速旋出针头；最后用骨蜡封闭颅骨孔，缝合头皮，并用碘伏消毒，置于恒温加热毯上直至苏醒再放回笼中，至此，建模完成。
5 全文总结与后续工作建议
5.1 全文主要结论
本文构建了一种具有ROS响应性的角蛋白纳米粒FKNBs，其目的在于治疗脑出血，促进ICH内源性血肿吸收，同时减轻由于CD163高表达导致的神经元损伤。ICH导致血脑屏障开放及通透性增加，且FKNBs具有靶向血肿功能，将FKNBs经尾静脉注射到ICH建模后的SD大鼠体内，其能够迅速聚集到脑内血肿周围，被血肿微环境产生的ROS破坏结构，从而释放出促血肿吸收药物Bex和神经元保护药物sCD163-Fc-C3。对纳米载药系统的制备过程进行了表征，并通过体内外生物活性评价对纳米载药系统的治疗作用进行研究，结果表明本文制备的纳米粒可有效促进ICH后血肿内源性吸收和特异性神经元保护，具有较好的生物相容性，为脑出血的治疗提供了新思路。
首先，制备了载Bex和sCD163-Fc-C3且具有ROS响应性的角蛋白纳米粒。通过原核表达技术成功获得了融合蛋白FBD-sK37-2α和sCD163-Fc-C3，SDS-PAGE结果显示其纯度和浓度较高，分子量与预测数值基本一致；利用合成的疏水性ROS响应分子NBC的酯基与FBD-sK37-2α中的氨基反应的特性制备FKN；进一步通过氢键、疏水相互作用和阳离子-π作用将Bex，sCD163-Fc-C3加载到自组装形成的纳米粒中；利用丁达尔效应、透射电镜观察、Zeta电位及粒径分析、核磁共振氢谱以及傅里叶变换红外光谱多方面表征证明了纳米载药系统FKNBs的成功制备，结果表明FKNBs分散性良好，较为稳定，具有类球形结构，粒径约为43.63 nm。
其次，完成了纳米粒活性氧敏感释药行为、靶向性及安全性的体外测定。载药率及包封率测定结果表明FKNBs对Bex载药率为19.65±1.22%，包封率为81.6±6.32%，对sCD163-Fc-C3载药率为14.87±0.51%，包封率为87.35±3.54%；并在纳米粒ROS敏感释放实验中，利用不同浓度H2O2模拟考察了药物到达体内环境中的释放情况，预示FKNBs在体循环中能够保持稳定，在到达脑血肿部位时能够较快释放；FITC-sCD163-Fc-C3与HT22共孵育实验结果表明sCD163-Fc-C3对HT22的靶向表现出时间依赖性，在24 h基本达到平衡；通过CCK-8法考察FKNBs的细胞毒性发现，FKNBs未对HT22细胞产生毒性，且对细胞有促进增殖作用，表明纳米粒能够有效降低Bex和sCD163-Fc-C3的细胞毒性。FKNBs在体外表现出的ROS敏感性、靶向性及安全性为进行其体内生物学评价提供了依据。
参考文献（略）
