药学论文哪里有？本课题以获得突变菌株为出发点，构建链霉菌H2S5细菌人工染色体（BAC）文库，对链霉菌H2S5中的安莎霉素生物合成基因簇（tym）异源表达。
第一章 基因簇大片段克隆技术研究进展
1.1 基因组文库
随着测序技术的高速发展，基因组信息得到深入研究，这促进了对新型BGCs的深度探索，从而得到了众多活性显著、结构新颖的天然产物。在直接克隆技术被研发出来之前，获得大片段次级代谢产物BGCs的DNA片段需要构建基因组文库。以基因组文库为基础的异源表达方法作为活化沉默BGCs的方法，具有通用性和全局性（张宏宇等 2020）。它理论上包含着目标物种的全部信息，可以使生物体的遗传信息以稳定的重组体形式储存起来。自1974年Murray等（1974）利用λ噬菌体载体成功构建基因组文库后，能够容纳更大片段、更稳定的载体逐步被研发出来（图1-2），这些载体包括λ噬菌体、cosmid、Yeast Artificial Chromosome（YAC）、P1-derived artificial chromosome（PAC）、Bacterial artificial chromosome（BAC）等，它们的结构和功能不断完善，各自具有其优缺点和适用领域，我们总结了其中能够容纳大片段DNA克隆载体的优缺点、载体目前的应用领域以及应用相关技术成功表达的天然产物生物合成基因簇（表1-2），以便根据载体的特点选择适合的载体对基因簇进行克隆。
第二章 H2S5基因组文库构建
2.1 研究背景
随着基因组测序技术以及生物信息学技术的飞速发展，研究者可以更直观地观察到微生物所蕴含的产生次级代谢产物的潜能。而随着大片段DNA克隆技术的发展，这种潜能逐渐地被开发，并逐渐用于分析已成功表达的天然产物的生物合成机理，或是通过活化沉默BGCs从而发掘出新颖的天然产物，或是异源表达目标基因生物合成基因簇以提高化合物的产量。结合基因组测序技术与大片段DNA克隆技术对次级代谢产物进行研究，已成为目前国内外的一个研究热点。
BAC作为目前应用最广泛的大型插入式DNA文库，容载能力一般为100- 300 kb，具有转化率高，遗传稳定，嵌合重组现象少等优点，因而越来越多地用于克隆含有复杂生物合成途径的大基因簇，以促进微生物代谢产物的异源生产（Chen et al. 2014）。
随着微生物分离技术和基因组分析技术的飞速发展，丰盛的微生物资源，特别是分离自特殊生长环境的放线菌（Subramani et al. 2012；唐丹 2019）越来越受科研工作者的重视和关注，并且研究人员随后从这些放线菌中取得了重要的科研成果。课题组在秦岭太白山北坡苔藓中分离到了一株放线菌H2S5，薛泉宏课题组（资源与环境学院）对H2S5进行分离和鉴定，并通过16S rRNA鉴定其属于可可链霉菌阿苏亚种。课题组前期在对该菌的研究中，分离出一系列具有广泛和显著活性的安莎霉素类化合物，然后完成了H2S5的全基因组测序。本研究旨在构建链霉菌H2S5基因组DNA的BAC文库，以便对三烯霉素的生物合成基因簇以及其他新颖的基因簇进行筛选。
第三章 基因组文库中目的基因簇阳性克隆筛选与异源表达
3.1 研究背景
在文库构建成功后，便可根据目的基因序列设计引物进行克隆筛选。常用的基因组文库筛选方法有高密度杂交膜筛选、原位杂交法、PCR筛选法等。与杂交膜筛选相比，PCR筛选更为灵敏；与原位杂交相比，PCR筛选操作相对简单，只需建立混合池，提取混合池质粒，就可以同时对多个目标基因进行筛选，从而免于单克隆质粒提取，同时还可避免原位杂交中可能出现的E.coli基因组DNA干扰等问题（夏晗等 2008）。并且PCR需要的仪器简单，绝大多数实验室均可进行操作，通过混合克隆的PCR，以尽可能少的反应次数从基因组文库中筛选出目阳性克隆，因此在文库筛选中被广泛应用。
对于次级代谢产物的开发、改造和生物合成研究，BGCs的异源表达必不可少。通过克隆完整的天然产物基因簇，使用异源表达方法来活化沉默BGCs或增加低产天然产物的产量，已经成为获得天然产物的有效手段（Huo et al. 2019）。而且与原始产生菌相比，基因簇在异源宿主中，更易于遗传操作（Gomez-Escribano et al. 2011）。当原始产生菌生长速率过缓、分离得到的天然产物含量低时，若想获得大量的化合物进行后续活性以及机制等的研究，选择合适的异源宿主，改变生长环境，就显得格外重要。
3.2 实验材料
3.2.1 菌株及材料
供体菌株：E.coli ET12567/pUZ8002 菌株； 受体菌株：streptomyces coelicolor M1146 材料：BAC文库
3.2.1 实验试剂及试剂盒
（1）2 ×YT培养基
（2）MS培养基
加去离子水定容至1L，高温灭菌20 min。固体培养基需要添加MgCl2，使其在培养基中的最终浓度达到10 mmol/ L，然后加入12 g/L琼脂粉。
第四章 结论
4.3 工作展望
不同宿主对BGCs的异源表达有很大的影响，关于三烯霉素tym的异源表达，对于筛选得到的阳性克隆可以在接下来的实验中尝试使用不同的接合转移方法以及异源表达宿主如Streptomyces lividans以及论文中提到的天蓝色链霉菌的其他变异菌株等，探索基因簇的异源表达条件，使基因簇在其合适的宿主内得到成功表达。
秦岭链霉菌H2S5野生型中分离得到的三烯霉素类化合物具有良好的抗肿瘤活性，但其生物合成机制仍不清楚，尤其是对5/6/7环稠合结构的催化生成反应机理的探索。
参考文献（略）
