药学论文哪里有？本研究基于性状鉴定以及DNA条形码技术对青果丸原料药材以及阳性对照药材西洋参进行鉴别研究，并通过ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK四种常用的DNA条形码相互印证，可成功鉴定到所有药材的基原物种，表明这些药材均为正品，为自制实验室青果丸样品提供了准确保证。
第一部分基于shotgun metagenomics技术的中成药生物成分物种鉴定的数据分析方法构建
随着高通量测序技术的发展，以物种遗传信息为依据的分子鉴定技术的优势逐渐显现。Shotgun metagenomics技术在微生物领域的应用非常广泛，主要通过该技术实现对微生物群落结构的分析[1-3]。该技术通过四个步骤实现对混合样品的分析，分别是将基因组DNA随机打断成小片段、构建测序文库、非靶向测序以及生物信息学数据分析[4]。Xin等人[5]在2018年首次将该技术用于中成药龙胆泻肝丸的物种鉴定分析中，通过数据质控、从Genbank中下载传统条形码构建数据库、将测序readsmapping到数据库上、单一k-mer进行组装以及以98%为阈值挑选有用的条形码进行草药识别等分析，实现了龙胆泻肝丸的物种鉴定。这一技术的成功应用，为中成药生物成分分析提供了新的方法和思路。然而，在这项研究中发现龙胆、柴胡、黄芩、地黄、当归、车前子、栀子等7种成分的至少1种Marker无法在2个自制样品中检出。因此，本研究将以三子散、五子衍宗丸和益母丸三种处方数量不同的中成药为测试数据集，对shotgun metagenomics数据分析方法进行重新构建，以期弥补已有方法的不足。
第三部分基于青果丸实验室自制样品对shotgun metagenomics数据分析方法适用性考察
3.2 psbA-trnH序列的组装结果比较
在HSZY163样品中，metaspades的组装结果显示，当k-mer取值为21时，能够获得5个物种的序列，未获得黄芩、青果和麦冬的组装序列；当k-mer取值为33和55时，未获得青果的序列；当k-mer取值为77~127时，能够获得所有物种的组装序列。megahit组装的结果显示，能够获得的物种数量在5~7个，当k-mer取值为21和127时，获得的物种数量是最少的，只能获得5个物种，但组装结果略有差异（表3-4）；当k-me取值为33时，未获得青果和麦冬的组装序列；当k-mer取值为55~111时，获得的物种序列最多，未获得青果的组装序列。
在HSZY175样品中，使用metaspades的结果显示，能够获得的物种数量在5~8个，当k-mer取值为21时，能够获得5个物种的序列，未获得黄芩、青果和麦冬的组装序列；当k-mer取值为33和55时，能够获得6个物种的序列，未获得黄芩和青果的序列；当k-mer取值为77时，未获得青果的序列；当k-mer取值为99~127时，能够获得所有物种的组装序列。使用megahit组装的结果显示，能够获得的物种数量在4~8个，当k-mer取值为111时，能够获得4个物种的组装序列，未获得黄芩、麦冬、青果和玄参的序列；当k-mer取值为21和127时，获得的物种数量是最少的，只能获得5个物种，但组装结果略有差异（表3-4）；当k-mer取值为33时，未获得黄芩和麦冬的序列；当k-mer取值为55~99时，能够获得所有物种的组装序列。详细结果见表3-4。
第四部分基于shotgun metagenomics技术的市售青果丸生物成分的物种鉴定
材料与方法
1材料收集
从承德同仁堂药店购买不同厂家的青果丸样品三份，样品保存于承德医学院中药资源实验室，生产厂家及生产批号见表4-1。
2试剂与仪器
参照第三部分“试剂与仪器”。
3实验方法
3.1市售青果丸样品的DNA提取、质量检测及高通量测序
中成药样品的DNA提取参照第三部分“实验方法”。
利用NanoDrop ONE型超微量分光光度计测定中成药DNA的OD值及A260/A280，A260/A230比值。
将提取的总DNA利用Illumina Novaseq平台进行shotgunmetagenomics测序。
3.2生物信息学分析
原始数据采用Trimmonmatic v0.39去除接头和低质量序列[16]；使用本地python程序脚本富集ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL片段；使用megahit v1.2.9和metaspades v3.13.2软件，构建de Bruijn图，对富集reads进行组装，k-mer值设置为33~127[17,18]；使用Cutadapt软件对叶绿体序列进行引物去除[19]；采用基于隐马尔可夫模型(HMM)的方法对ITS2区域进行基因注释[20]；使用cd-hit软件将多条序列按照99%相似度进行聚类，获取每一个OTU聚类中的代表性序列进行分析[21]；采用bowtie2v2.4.1软件对代表性序列进行短序列mapping[22]，并基于samtools v1.10去除测序深度≤3和覆盖度≤95%的序列[23]；通过BOLD数据库以及Genbank数据库进行序列比对，对保留的高质量的OTUs进行物种分配[24]；使用本地python脚本对测序reads进行计数；最后，采用MEGANv6.18.9软件对青果丸中的物种组成进行统计和分类可视化[25]。
结果
1青果丸样品DNA提取结果
对3份市售青果丸样品进行DNA提取和质量测定，使用NanoDropONE型超微量分光光度计对3份样品DNA质量和浓度进行了测定，A260/A280均在1.80~2.00之间，说明提取的DNA纯度较高，具体结果见表4-2。
结论与展望
2.展望
本研究基于shotgun metagenomics技术，成功分析了自制和市售青果丸样品的物种组成。然而，对于不同的条形码片段，鉴定结果存在一些差异，如在三份市售样品中均未检测到麦冬完整的psbA-trnH序列，主要原因可能是：psbA-trnH片段获取困难，导致产生的reads较少，不能达到很好的组装效果；psbA-trnH序列本身存在长度变异大、poly结构较多、种内倒位和rps19基因插入等问题[1,2]，导致该片段的鉴别效率下降。此外，青果丸为水蜜丸，提取DNA过程存在不稳定性，导致某些成分未提取出来或者提取量未达到测序要求，而shotgun metagenomics测序技术的成功应用基于高质量DNA的提取。中药材所含成分繁多，不同的药用部位所含DNA含量不同，化学物质的种类和多少也不相同，这些因素均会影响提取的DNA质量[3]。针对不同物种，shotgunmetagenomics检测能力具有一定的差别，比如，黄芩和麦冬均以块根入药，青果以果实入药，富含多糖、多酚及各种次生代谢产物，常规的提取方法不能很好的去除这些次生代谢产物，提取的DNA往往含有较多杂质，导致检测不出物种序列，影响分子生物学实验结果[4-8]。因此，今后的研究应该进一步改进提取的中成药的DNA的质量，从而提高中成药鉴定效率。
目前在中成药生物成分分析中应用最为广泛的分子技术仍然是二代高通量测序技术，该技术能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定[9]，成本低、准确率高，然而数据分析方法相较于一代测序更加困难，尤其是在序列组装和注释上，本研究建立的数据分析方法已经可以用来解决大部分中成药生物成分的物种鉴定问题。在未来的研究中，可以选择本研究建立的数据分析方法对混合样品进行生物成分的物种鉴定研究，也可以采用第三代高通量测序技术，该技术的主要优点是读长极长，在一定程度上降低了序列组装的困难。然而，第三代测序的通量较低，成本较高且准确率也不高。有研究采用long-read shotgunmetagenomics方法对口腔噬菌体进行研究，结果表明了该方法在揭示具有增强scaffolding的噬菌体、其基因特性及其与宿主细菌免疫的相互作用方面的能力[10]。由此可以看出，如果能够降低长读测序的成本，提高测序的准确性，那么长读宏基因组学就具有广泛的应用前景。
参考文献（略）
