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第一章 绪论
1.1 谷胱甘肽研究概述
谷胱甘肽（GSH），别名 5-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸[1]。它是甘油醛磷酸脱氢酶的辅基，又是磷酸丙糖脱氢酶以及乙二醛酶的辅酶，参与体内三羧酸循环和糖代谢，使人体获得高能量[2]。它是体内最丰富的硫醇物种，能激活体内疏基（-SH）酶，例如与过敏性疾病相关的胆碱酯酶。它还保护机体免受重金属及环氧化合物的毒害，能促使脂肪、蛋白质及碳水化合物的代谢，同时也能控制细胞的代谢过程。此外，还有放射性保护及抑制黑色素沉着等作用[3]。1931 年Rapkine 首次报道了巯基化合物的浓度在有丝分裂期间发生了变化，这证实了SH/SS（氧化/还原）循环的存在，并揭示了巯基化合物可能具备一些基本的生物学功能[4]。1952 年，Barron 经过大量文献的回顾总结，应用资料外推法提出了“GSH 激发 SH-酶的活性，是细胞呼吸的常规机制”[5]。接着，对 GSH 的研究工作由 Krebs、Hems、Vina 于 20 世纪 60-70 年代在牛津代谢研究实验室展开[6]。
1.1.1 谷胱甘肽的结构
谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物[7]。它于 1921 年被 Hopkins 发现[8]，1930 年确定其化学结构[9]，如图 1-1 所示。由于半胱氨酸上的巯基是谷胱甘肽的活性基团，故常简写为 G-SH。谷胱甘肽是一种非常特殊的氨基衍生物，在谷氨酸与半胱氨酸之间存在着一个不多见的γ-肽键，从而保护了 GSH 被许多肽酶的水解[10]。它是含有巯基的小分子肽类物质，分子式为 C10H17O6N3S（如图 1-2 所示），状态为白色结晶性粉末，谷胱甘肽纯结晶体在 190-192℃熔融而分解，比旋光度[α]D27-21°（C=2.74），[α]D25-18.9°（C=4.653），极易溶于水，不溶于有机溶剂。谷胱甘肽有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数，含量占到约 99.5％[11]。它广泛分布于动植物细胞内，在肝脏和晶体中含量较多。现在可由化学法或发酵法生产[12]。
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1.2 生物传感器的简介
生物传感器是一个非常活跃的，发展迅猛的研究学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测与监控装置。这种新的检测装置具有以下几个优点: （1）可进行活体检测；（2）成本远低于大型分析仪器；（3）体积小、响应快、准确度高，可以实现连续在线检测；（4）一般不需要进行样品的预处理，可将样品中被测组分的分离和检测统一为一个整体，使测定过程既简单又迅速，较易实现自动分析。所以，生物传感器以其高灵敏性、高选择性和可连续测定等显著优点，在医学、食品工业、生物工程、临床检测和环境污染物分析等领域展示出了十分广阔的应用前景[60-64]。生物传感器是以固定化生物活性物质（酶、DNA、蛋白质、微生物及生物膜等）作为敏感元件与换能器有机结合而组成的一种先进的分析检测装置，其工作原理如图 1-16 所示[66]。当待测物质经扩散作用进入分子识别原件时，经分子识别作用与分子识别元件特异性结合发生生物化学反应，产生的生物学信息通过相应的信号转换元件转换为可以定量处理的电信号，在经过电子测量仪的放大、处理和输出，即达到分析检测的目的。
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第二章 基于汞离子介导的链置换反应策略实现对谷胱甘肽的电化学检测
2.1 引言
谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽化合物[1]。它作为生命有机体中含量最丰富的巯基化合物，在细胞转导、异型生物质的新陈代谢、基因调节以及维持细胞内氧化还原的平衡等功能中有至关重要的作用[2-5]。此外，谷胱甘肽也是众所周知的内因性解毒剂，活跃的巯基可以与药物、毒素和重金属等不同成分相互作用[6-8]。同时，谷胱甘肽作为一种有效的抗氧化剂已广泛应用于抗衰老、抗肿瘤和提高免疫力等方面[9-11]。近年来，有关研究发现细胞内谷胱甘肽的表达水平与很多人类疾病息息相关[12-20]。因此，谷胱甘肽在细胞内外都扮演着重要的作用，迫切需要发展一些更简单但有效的方法来监测生理和病理条件下的谷胱甘肽。在过去的几十年，各种各样的分析技术被应用于谷胱甘肽的检测，包括高效液相色谱法、质谱分析法、比色法和荧光技术等[21-28]。目前，电化学技术得益于成本低、响应快、操作方便、高灵敏性和特异性等特点已发展成为检测谷胱甘肽的有力技术。例如，Safavi等人提出了一个通过使用氢氧化铜纳米与碳离子液体的复合电极络合二价铜复合物检测谷胱甘肽的电化学方法；Shahmiri等人设计了一个通过二茂铁乙烯和氧化镍/多壁碳纳米管修饰碳糊电极的新型伏安传感器来检测谷胱甘肽；Yuan等人提出了一种通过Cu2O/NiOx/石墨烯修饰在玻碳电极上的电化学方法检测谷胱甘肽 [29-31]。但是，上述方法都是通过对电极的复杂修饰和改造来氧化还原谷胱甘肽，进而捕获电化学信号。鉴于这些方法相当复杂的修饰过程和直接响应谷胱甘肽电化学信号的限制性，应该发展更简单但灵敏的电化学生物传感器来取代复合膜修饰电极的方法检测谷胱甘肽。
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2.2 实验材料和方法
（1）Milli-Q 超纯水纯化系统（Branstead， 美国）（2）pH 计（FE20，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）（3）电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240A，上海慧泰仪器制造有限公司）（4）电子天平（MA110，梅特勒托利多仪器上海有限公司）（5）恒温振荡器（ZHWY-100H，上海凌普有限公司）（6）超声仪（SG5200HPT，上海冠特超声仪器有限公司）（7）移液枪 （2.5 μL， 10 μL ，20 μL，100 μL，200 μL，1000 μL）（Eppendorf,德国）（8）电化学分析仪（CHI660C，上海辰华仪器有限公司）（9）金电极（3mm)（上海辰华仪器有限公司）（10）砂纸、铝粉和抛光布（上海辰华仪器有限公司）（11）三电极系统（金电极作为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂电极)（上海辰华仪器有限公司）
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第三章 基于配体交换辅助的 DNA 模板化银纳米颗粒的释放.......51
3.1 引言............51
3.2 实验材料和方法..........52
3.2.1 试剂与材料........52
3.2.2 仪器...........53
3.2.3 DNA 模板化银纳米颗粒的合成...........53
3.2.4 从海拉细胞中提取谷胱甘肽.......54
3.2.5 谷胱甘肽包被的银纳米颗粒的释放和分离..........54
3.2.6 谷胱甘肽的电化学检测......54
3.3 结果与讨论........55
3.3.1 检测方法的原理.........55
3.3.2 检测方法的电化学研究......56
3.3.3 检测条件的优化.........57
3.3.4 谷胱甘肽的电化学检测......57
3.3.5 检测方法的特异性.....59
3.3.6 细胞内谷胱甘肽的检测......60
3.4 结论...........61
3.5 参考文献....61
第三章 基于配体交换辅助的DNA模板化银纳米颗粒的释放实现细胞内谷胱甘肽的电化学检测
3.1 引言
谷胱甘肽，别名 5-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸[1]。生物有机体代谢产生的过量自由基的会损害生物膜甚至体内大分子[2]。谷胱甘肽作为体内最有效的抗氧化剂可以清除多余的自由基，从而保护细胞免受活性氧（ROS）的损伤[3,4]，同时谷胱甘肽还可以作为解毒剂与有毒化合物如铅、汞、砷等相互作用提高人体免疫力[5-7]。因此，细胞内谷胱甘肽异常的水平与人类各种疾病密切相关[8-13]。鉴于检测细胞内谷胱甘肽的重要性，很有必要发展更有效的方法来监测生理和病理条件下的谷胱甘肽。在过去的几十年间一些分析技术已经被应用于测定谷胱甘肽，包括比色法、荧光技术、质谱和高效液相色谱法等[14-18]。目前，电化学技术因成本低廉、反应快速、操作简单的独特优势在生物分析中广受欢迎 [19,20]。由于信号分子的特性和可靠性直接影响检测的灵敏度，不同类型的电活性分子已被开发使达到高灵敏度的电化学检测[21-23]。随着纳米技术的迅速发展，纳米材料，特别是金属纳米粒子，已成为构建电化学生物传感器的一个最具吸引力的信号资源[24-26]。其中，银纳米颗粒作为最重要的纳米材料之一，表现出理想的分析功能，如合成的便利性、电化学催化活性和信号放大特性[27,28]。目前，有三种常用的银纳米颗粒的合成方法，包括物理、化学和生物方法[29]。其中，以 DNA 为模板原位合成银纳米颗粒作为一种典型的生物方法自 Dickson 等人首次提出以来就受到了人们的广泛关注[30]。可优化长度的寡核苷酸链为银纳米颗粒的合成提供一个适当的支架，银离子选择性地吸附到杂环碱基以硼氢化钠（NaBH4）作为还原剂将银离子还原形成银纳米颗粒。DNA 模板化合成的银纳米颗粒在构建生物传感器中表现出很多优点。一方面，DNA 模板可以有效地阻止银纳米颗粒在合成过程中聚集，因而 DNA 功能化的银纳米颗粒有较好的电子、物理和化学性质；另一方面，DNA 支架可以为分子识别、信号标记、甚至信号放大提供许多有利的选择，以增强电化学检测的特异性和灵敏性。#p#分页标题#e#
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总结
谷胱甘肽是细胞内含量最丰富的非蛋白硫醇。机体内谷胱甘肽主要以还原型的状态存在，还原型谷胱甘肽具有保护细胞免遭氧化损伤的重要作用。研究机体内还原型谷胱甘肽的含量，可以评价机体的氧化应激情况和疾病发生的风险。虽然很多学者都对体内的氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽进行了检测，但是检测结果差异较大。这是由于谷胱甘肽发生自氧化从而造成谷胱甘肽的低估。而我们构建的电化学生物传感器简单高效，缩短了反应时间，避免了谷胱甘肽的自氧化。电化学技术也以其灵敏、高效的检测优势在医学诊断、生物分析领域中发展迅速，逐渐成为临床医学检验中重要方法之一。其中，结合具有电活性的小分子和纳米材料独特的性质作为灵敏的信号源构建的电化学 DNA 生物传感器成为一种具有代表性的电化学传感器，不仅融合了 DNA 分析和电化学技术的优势，在针对疾病靶标的检测体系中表现出特异性强、灵敏度高、检测迅速、样品消耗量少的特点，而且由于操作简单、无需标记且实验成本低等优势在临床检测方面表现出较强的实际应用价值。本论文基于电化学表征技术，以具有电活性的小分子（亚甲基蓝）和纳米材料（银纳米颗粒）作为检测探针成功构建了谷胱甘肽电化学检测的新方法，完成了以下两项工作：
（1）构建了一种电化学新方法，通过二价汞离子介导的链置换反应辅助亚甲基蓝这种电活性信标分子距离电极的远近控制信号的强弱变化，利用方波伏安法的测定分析来实现谷胱甘肽的灵敏检测。检测限为 0.14 nM，且特异性强，可以有效地区分靶标与其他对照氨基酸和蛋白，也可在缓冲液和血清样本中高特异性的区分靶标分子。
（2）发展了一种电化学新方法检测细胞内的谷胱甘肽，利用单链 DNA 模板合成银纳米颗粒，通过谷胱甘肽与银纳米颗粒间较稳定的 Ag-S 交互作用辅助的配体交换过程，可以诱导银纳米颗粒从单链模板 DNA 释放。经磁性石墨烯分离后，谷胱甘肽可以通过跟踪银纳米颗粒响应的电化学信号，经阳极溶出伏安法实现有效的“信号上调”的灵敏检测，检测限为 0.023 nM，且特异性良好，也可在缓冲液和血清样本中，甚至在海拉细胞中表现出较高的特异性。
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参考文献（略）
