本文是一篇硕士论文，高等学校和科学研究机构的研究生，或具有研究生毕业同等学力的人员，通过硕士学位的课程考试和论文答辩，成绩合格，达到下述学术水平者，授予硕士学位。（以上内容来自百度百科）今天为大家推荐一篇硕士论文，供大家参考。
第 1 章 绪论
1.1 Potyvirus 研究概况
植物病毒危害范围广传播性强，十九世纪初期首次被人类发现并研究至今。Potyvirus 是植物病毒中最大的一个属，据 ICTV 第九次报告结果[1, 2]显示，Potyvirus病毒共包含 146 个种，及 32 个暂定种，Potyvirus 隶属于 Potyviridae，在植物病毒所有属中所含种类最多。该属的确定种在植物病毒的各大属中所含成员最多，对作物的经济危害也最为严重，该属病毒的传播途径为虫煤，可通过蚜虫进行传播，马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y, PVY）是该属的代表中，具有典型的 Potyvirus 特征。本文研究的小西葫芦黄花叶病毒、西瓜花叶病毒、辣椒脉斑驳病毒均是 Potyvirus成员。目前普遍认为，能够作为植物病毒种的鉴定方式、分类标准的，只有病毒的基因组结构及碱基序列[3]。由于病毒 cp 基因组相对保守，在不同病毒或者同一病毒的不同分离物之间存在差异较小，近几年，伴随着基因工程的发展及基因组测序技术的完善，植物病毒中的许多种的 cp 基因序列被测出，完善了病毒种的分类，尤其是那些亲缘关系近的、株系划分不明确的病毒，通过测序及生物信息学手段对序列进行分析，进而判断其同源性及分类，通过利用这种鉴定方式测定了许多病毒的全基因组序列，丰富了植物病毒种的分类[4-6]。Potyvirus 的 cp 基因的氨基酸序列分为三个区域[6]：N-端、核心区、C-端。Shukla[6]等首先利用序列比对分析了Potyvirus 之间的亲缘进化关系。
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1.2 小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV）
小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV）是马铃薯 Y 病毒科（Potyviridae）马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus）的成员[32]。ZYMV 小西葫芦分离物最先由 Lisa[33]等在意大利、法国报道，在世界范围内均有分布。ZYMV 病毒粒子为弯曲线状，无包膜，长度为 750nm，基因组长为 9.5kb 的单链正义 RNA（Positive single-stranded RNA, +ssRNA），5’-端具有一个共价结合基因组连接蛋白(viral protein genome-linked, VPg)，3’-端为 20-160nt 个腺苷酸组成的 Poly(A)尾巴[34]。基因组编码一个 350 kDa 的多聚蛋白(Polyprotein)，随后切割成解旋酶、复制酶和衣壳蛋白等 8~10 个蛋白参与病毒的复制、运动和包装[35]。目前，研究较深入的是 ZYMV 的衣壳蛋白，发现 cp 蛋白除了参与病毒的组装，还参与病毒转录、移动和介体传播[36]。ZYMV 可通过媒介、种子、及机械接触三种方式进行传播。虫媒传播主要通过口器刺破植物组织，携带宿主组织汁液通过伤口处传播[37-39]，传播介体包括蚜虫、桃蚜、棉蚜等；据有关文献记载，ZYMV 侵染寄主种子，将直接造成种子不萌发，且传毒率相对较低[40]，约为 0~18.9%[40]；机械接触传播主要以人工修剪枝条的方式进行，是 ZYMV 的一种重要传播途径，据 Simmons[40]等研究发现，机械接触成为ZYMV的主要传播途径。ZYMV在自然界可侵染多种植物作为寄主繁殖，自然寄主主要为葫芦科作物，目前已报道的寄主植物有西葫芦、黄瓜、甜瓜、冬瓜、南瓜[41]、西瓜[42]、罗汉果[43]、苦瓜、丝瓜[44]、瓠瓜、节瓜[45]、香瓜[46]等，常造成叶片出现坏死、褪绿或黄斑驳等症状，严重则果实畸形，影响作物的产量和商品价值[47, 48]。自 ZYMV 发现以来，便成为研究者的关注对象，并在欧洲、南美、澳洲、亚洲、地中海[49]等地区相继被报道。1991 年我国首次报道了 ZYMV-新疆西瓜分离物，自发现以来已在我国大部分地区扩散。目前已报道的地区有北京[50]、山东[51]、湖南[46]、江苏[52]、广西[43]、广东[53]、甘肃[41]、新疆[54]等地，但尚未见其在辽宁发生的相关报道。
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第 2 章 小西葫芦黄花叶病毒辽宁南瓜分离物的鉴定与序列分析
小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)是马铃薯 Y 病毒科（Potyviridae）马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus）的成员，病毒粒子呈弯曲现状（长750m,+ssRNA），外表面无荚膜结构。该病毒主要通过蚜虫进行传播，寄主主要有西葫芦、南瓜等葫芦科作物，鉴别寄主为本氏烟和洋酸浆。
2.1 实验材料及试剂
2.1.1 实验材料
2016 年 8 月采自于辽宁沈阳、辽宁盖州的南瓜（Cucurbita moschata）花叶植物叶片，-80℃保存于本实验室。
2.1.2 菌株及质粒载体
大肠杆菌 DH-5α 菌株购置于 TIANGEN（天根生化科技（北京）有限公司）；PMD-18T、PMD-20T 连接试剂盒购置于 TaKaRa（宝生物工程（大连）有限公司）
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2.1.3 生化及分子生物学试剂
生化试剂（国产分析纯）：磷酸二氢钠(NaH2PO3)、磷酸氢二钠(Na2HPO3)、葡萄糖(Glucose)、氢氧化钠(NaOH)、丙三醇、Tris-HCl、EDTA、EDTA-2Na、SDS、KAc(乙酸钾)、醋酸（CH3COOH）、Typto、Yeast、氯化钠(NaCl)、琼脂、Tris、EB染液、2%磷钨酸、硼酸、Tris-碱、盐酸、CTAB、RNA 酶 A(RNase-A)、AMP、氯仿(CH(Cl)3)、异戊醇、DEPC、戊二醛。实验用配制试剂：PB buffer、PBS 缓冲液、20%Glucose、2NNaOH、10%SDS、质粒提取试剂（SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ、）LB 液体培养基、LB 固体培养基、5×TBE、Tris-HCl、CTAB-free buffer、TE 缓冲液、0.5N EDTA、1.0%AMP、苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、氯仿：异戊醇（24:1）、0.5mol/L NaCl、0.1%DEPC水、2.5%戊二醛、2%磷钨酸。（配制方法参考于《分子克隆实验指南》）。
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2.2 引物的设计与合成
依据已报道的 ZYMV cp 序列，采用 DNAMAN、DNAStar 软件进行设计，本文中使用到的引物的寡核苷酸序列见附录 A，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取新鲜的典型花叶症状叶片，置于研钵中，加入 10%PBS 缓冲液至刚好没过叶片，研磨，将样品研磨成匀浆状，置于 1.5mlEppendorf 管中，室温下5000rpm-6000rpm 离心 3min。吸取液体另放于新管中，取植物病毒粗提液 20μl，2%磷钨酸 50μl 于表面皿上，首先将铜网置于粗提液上表面，为了使样品汁液附着于铜网中，将铜网停留在样品上 3min，染色 10s，滤纸吸干液体，放置于表面皿中备用；将样品置于透射电镜下（Hitachi TEM system）观察（实验地点：沈阳农业大学分析测试中心）。
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第 3 章 西瓜花叶病毒辽宁臭椿分离物的鉴定与全序列分析...........24
3.1 实验材料..........24
3.1.1 实验材料.......24
3.1.2 菌株及载体...........24
3.2 实验方法..........25
3.3 实验结果与分析......29
3.4 讨论 ......... 33
第 4 章 辣椒脉斑驳病毒辽宁龙葵分离物的鉴定与序列分析 .......... 35
4.1 实验材料及菌株 ..... 35
4.1.1 实验材料 ...... 35
4.1.2 菌株及载体 .......... 35
4.2 实验方法 ......... 36
4.3 实验结果与分析 ..... 38
4.4 讨论 ......... 41
第 5 章 马铃薯 Y 病毒辽宁番茄分离物的鉴定与序列分析...... 42
5.1 实验材料及菌株 ..... 42
5.1.1 实验材料 ...... 42
5.1.2 菌株及载体 .......... 42
5.2 实验方法 ......... 43
5.3 实验结果与序列分析 ..... 44
5.4 讨论 ......... 45
第 5 章 马铃薯 Y 病毒辽宁番茄分离物的鉴定与序列分析
马铃薯 Y 病毒（potato virus Y, PVY）是 Potyvirus 的代表种，于 1931 年首次被 Smith 在马铃薯上发现，并在 50 年代初期逐渐被人类认识。PVY 基因组为单链正义 RNA（Positive single-stranded RNA, +ssRNA），基因组全长约 9.7kb，透射电镜观察病毒粒子长 700-750nm，主要通过虫媒及机械切割进行传播。
5.1 实验材料及菌株
利用 TRIzol 法对番茄花叶样品进行 RNA 提取，提取方法详见第三章。取RNase-free Eppendorf 微量 PCR 管，依次加入 2μM4-T( 18)（10 μmol·L-1），3μg RNA，2μl Super Pure dNTPs（2.5mmol each），补 RNase-Free ddH2O 至 14.5μl，混匀，70℃温浴 5min；迅速置于冰上静置 2min；瞬离后依次加入 4μl 5×First-Strand buffer，0.5μl RNase 抑制剂（20 U·μL-1），1μl TIANScript M-MLV 反转录酶（200U·L-1），用枪混合均匀，42℃温浴 50min，反应结束后于 95℃下温浴 5min 以终止反应，瞬离反应液置冰上冷却，待温度降至室温后加入 RNase-Free ddH2O 稀释至 50ul 备用。利用 Potyvirus 通用引物 PVY-Legpoty-F（5’-GCWKCHATGATYGARGCHTGGG-3’）、PVY-Legpoty-R（5’-AYYTGYTYMYCHCCATCCAT-3’）进行 PCR 扩增。PCR 反应循环参数为：94℃ 3min；94℃ 3 0s，45 ℃ 30s，72℃ 3 5s，实验进行 35 个循环；72℃延伸 7min。PCR 扩增结束后，加入 6×loading Buffer TBE 凝胶电泳检测、纯化 PCR 产物。#p#分页标题#e#
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结论
（1）经实验表明，南瓜花叶病（三个盖州样品、三个沈阳样品）的病原为ZYMV。利用 Potyvirus 通用引物 PVY-Legpoty-F/R 扩得 701bp 条带，经测序结果显示，该片段与 ZYMV 高度同源。根据 ZYMV cp 设计 ZYMV 特异性引物ZYMV-CP-F/R 经 RT-PCR 扩得 1.2kb 片段，包含完整的 cp 基因，长度为 849bp，GenBank 登录号是 KY495594- KY495599。ZYMV-LNsyA 和 ZYMV-LNgzA 同ZYMV 中国、韩国的分离物的 cp 基因同源性最高。
（2）利用 PVY-Legpoty-F/R 扩臭椿花叶 cDNA 样品，得到 750bp 片段，测序结果显示，该片段与 WMV 高度同源。利用小 RNA 测序技术对臭椿病毒病样品进行测序，根据测序结果设计引物 WMV-5NF/R、WMV-MF/R、WMV-3NF/R，并扩得 WMV-臭椿辽宁分离物全长基因组序列，全长为 10070bp（GenBank 登录号为MF418043）。Potyvirus 的分类主要依据 cp 氨基酸以及 3’-UTR 序列的同源性，通过分析我们发现，WMV-臭椿分离物同北京分离物同源性最高，这是辽宁臭椿上WMV 分子特征的首次报道。
（3）利用 PVY-Legpoty-F/M4扩龙葵黄斑驳植物 cDNA 样品，得到 737bp 片段，经测序结果显示，该片段与 ChiVMV 同源性较高，确定龙葵黄斑驳病病原为ChiVMV 分离物。根据 ChiVMV cp 基因设计 ChiVMV 特异性引物 ChiVMV-CP-F/R，利用 RT-PCR 法扩增得到 1103bp 片段，包含完整的 cp 基因序列（863bp，编码 287个氨基酸）。这是 ChiVMV 辽宁龙葵分离物的首次报道。
（4）利用PVY-Legpoty-F/R对辽宁盖州番茄黄化样品RNA进行RT-PCR扩增，得到约 750bp 阳性条带。测序结果显示，该片段大小为 677bp 不含完整的 cp 基因。同源性比对发现该段基因序列同 PVY 病毒序列高度同源性，确定为 PVY 的一个分离物。
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参考文献（略）
