医学论文哪里有？本论文以检测细胞中的mRNA为出发点，通过纳米孔检测技术设计了一种新型的mRNA检测方法。相关实验证明，通过该方法能够实现细胞样品中的mRNA检测，进而实现研究药物对细胞样品中mRNA调控。
1 绪论
1.2 mR NA检测国内外研究现状
目前，mRNA检测技术种类纷繁复杂，国内外成熟的商业方法主要包括测序法、Northern印记杂交法（Northern blot）、聚合酶链式反应法（PCR）,如图1.1所示。测序法具有高通量、高灵敏度、自动化程度高等优势，可以同时完成传统基因组学和功能基因组学的研究，但存在测序成本较高、耗时长等不足。Northern blot方法可以对mRNA进行定量分析，结果可靠，但需经历样品的提取与制备、样品转移、探针标记、杂交、洗膜等步骤，操作过程较繁琐。PCR技术可对目标核酸进行扩增，具有高灵敏性，但耗时长，使用要求比较严格，容易出现因实验污染或操作污染导致假阳性或假阴性结果的出现。
由于现有技术制约了mRNA的检测分析，因而推动了新兴技术在mRNA检测上的应用。科研人员尝试采用荧光法、电化学法、化学发光法等方法实现技术突破（如图1.2所示）。例如，Rhiannon L N等人通过荧光法对mRNA进行检测[20]。他们引入含有两种不同荧光颜色的DNA探针：一个探针5 ’端与红色染料相连；另一个探针5 ’端与绿色染料相连。当两个探针与目标序列混合时，探针与目标序列通过碱基互补配对作用相互结合(黑色所示)，并发出红色和绿色的荧光，从而实现mRNA的检测。荧光检测法虽具有高灵敏度、高选择性、操作简单等优势，但易受到环境因素的影响，如斯托克斯位移、光稳定性以及猝灭效应等。Liu J等人设计了一种可切换的电化学传感器，用于检测活细胞中的survivin mRNA[21]。该研究团队将含有二茂铁修饰的DNA片段固定在电极表面，且该探针DNA 二茂铁标记物可通过细胞转染进入细胞。
3 基于纳米孔检测mR NA的方法验证
3.2 实验部分
3.2.1 实验试剂与材料
本实验用到的主要试剂与材料如表3.1所示。
4 纳米孔检测药物作用下mR NA的调控水平
4.1 引言
AGS（人胃癌细胞）可表达胃上皮分化的标志物，例如粘蛋白。该细胞对部分化疗药物和放射治疗敏感，可作为细胞转染的宿主。因此，AGS通常用作研究胃癌和评估潜在疗法的模型系统，并为耐药机制的研究提供策略。SMMC-7721（人肝癌细胞）生长较迅速稳定，在免疫缺陷小鼠体内可成瘤，常被用作研究肝癌的分子机制和治疗策略。
mR NA在生物体的转录、蛋白质翻译过程中有着关键性作用，还参与调控基因的表达。通过对mRNA表达量的研究，将为疾病的诊断和治疗提供新方法。因此，本实验将通过纳米孔检测平台对细胞加药前（AGS MocK、SMMC MocK）和细胞加药后（AGS 10 CA、SMMC 10 CA）进行检测分析，以P2RX7 mRNA为检测目标，研究药物对细胞中mRNA的调控作用。该研究将为评估新药物的疗效，筛选新的治疗方法提供依据，并为研究新型低毒性的抗肿瘤治疗、护理结合治疗提供新方法。
4.2 实验部分
4.2.1 实验试剂与材料
实验中用到的试剂与材料如表4.1所示
纳米孔实验装置由纳米孔样品池、膜片钳检测系统、屏蔽罩和减震台组成，如图2.2所示。屏蔽罩和减震台用于减小实验过程中噪音，整个纳米孔样品池处于屏蔽罩内。纳米孔检测装置由Teflon膜和两个检测腔室（顺式端为cis端，反式端为trans端）组合而成，其中距Teflon膜底部3 mm左右存在一个由电火花打孔装置产生的约150 μm的微孔。聚四氟乙烯样品池中的大孔为Ag/AgCl电极插入口，小孔为电解质缓冲液注入口。膜片钳检测系统由探头、Ag/AgCl电极、膜片钳放大器、数模转换器、函数信号发生器和信号显示装置组成。Ag/AgCl电极将纳米孔检测装置和探头连接，探头用于捕捉电信号并传送至膜片钳放大器，放大器通过运算变换将pA量级的微弱电流信号放大，放大后的模拟信号由数模转换器转换为数字信号并通过信号显示装置显示。函数信号发生器用来表征磷脂双分子层的形成和纳米孔蛋白通道的构建，该仪器通过发射三角波使输入信号形成矩形方波。
5 总结与展望
5.2 展望
现阶段，纳米孔检测技术在单分子检测领域已取得喜人进展，基于纳米孔检测得到广泛应用。相较于传统检测方法，纳米孔检测技术具有操作简便、无需标记、样品需求低、便于携带和高灵敏度等优势，拥有广阔的应用空间。本论文以检测细胞中的mRNA为出发点，通过纳米孔检测技术设计了一种新型的mRNA检测方法。相关实验证明，通过该方法能够实现细胞样品中的mRNA检测，进而实现研究药物对细胞样品中mRNA调控。该方法将推动纳米孔检测技术在mRNA检测方面的应用，为临床医学研究做出贡献。尽管如此，本项目仍存在以下几点需要改进：
（1）目前该生物纳米孔检测方法虽实现了对细胞样品中mRNA的检测，但检测限还有待提升。后续可通过提高酶切效率、优化探针设计、使用不对称缓冲盐溶液等方法进行优化，提高检测限，并且实现mRNA超低浓度定量检测。
（2）对实验条件进行优化后，可通过生物纳米孔传感器探讨血液样品中mRNA检测的可行性。因为血液环境中的基质较复杂，而且可能存在其他与LVFFAEDVGSN类似大小和带有同样静电荷的多肽，造成背景信号干扰。另一方面，复杂的血液样品可能抑制胰蛋白酶的活性，降低该探针的检测限。因此，后续可以采用真实样本检测，论证该方法的实际可用性。
参考文献（略）
