医学论文哪里有？本研究利用慢病毒包装技术，成功的构建了ITGβ2过表达细胞株，并从mRNA水平、蛋白水平以及IFA进行了验证，结果表明，与对照组相比ITGβ2基因在过表达后，细胞中表达显著上调。
1细胞培养技术的研究进展
1.1贴壁细胞培养技术
所谓贴壁型培养就是一种将细胞附着在某种载体上的培养方法，从而使其能够进行有丝分裂，也是细胞常见的一种培养方法[14-16]。由于人类对生物药品的需求量越来越高，该方法很难扩大生产规模，提高细胞质量和产量已经成为企业保持竞争优势的重要途径。为了保证生物医药产品的质量，适应于市场需求，目前已开始采用从转瓶法向更大规模的培养方式转变。
近年来，研究开发并应用微载体细胞培养技术，是一种能够有效进行细胞大规模培养方法之一[17]。微载体细胞培养技术是一种可以应用于贴壁型和悬浮型细胞的培养方法[18]。自从1967年以来，在动物细胞大规模培养中微载体培养技术得到了应用[19]，经过30多年的发展，这一技术已经变得越来越完善和成熟，例如Vero细胞、MDCK细胞以及Marc-145细胞等可以利用微载体细胞培养技术培养后，广泛应用于生产病毒疫苗和基因工程产品等。
3结果
3.2慢病毒表达质粒
经PCR扩增后得到约2414 bp大小的片段，与加上保护碱基的预测片段大小2414 bp相符，样品的扩增结果(图4-2 A)。将PCR扩增的得到的目的基因构建到pCDH-CMV载体，获得的条带约2440 bp、8154 bp与预期2440 bp、8154 bp的大小一致。酶切结果表明获得了含ITGβ2基因的重组质粒(图4-2 B)。
3.3以慢病毒为载体转导Vero细胞后ITGβ2表达水平的检测
在荧光显微镜下观察Vero细胞组和Vero-ITGβ2细胞组中细胞的荧光率，以评估以慢病毒为载体转导Vero细胞后ITGβ2表达水平的检测，结果显示，Vero细胞组有荧光表达，而Vero-ITGβ2细胞组比Vero细胞组荧光强度较高(图4-3 A)。用Western blot检测Vero细胞组和Vero-ITGβ2细胞组表达情况，Image J软件进行灰度值分析，结果显示，Vero细胞组比Vero-ITGβ2细胞组中蛋白表达量显著降低(图4-8 B)。使用实时荧光定量PCR检测Vero细胞组和Vero-ITGβ2细胞组mRNA水平的变化，结果显示，Vero-ITGβ2细胞组比Vero细胞组基因的表达量显著增高。
4讨论
SDC4通过介导蛋白激酶C-α(protein kinase C-α，PKC-α)的激活来调控整合素β1的内吞作用，从而调节Focal adhesion的信号传导[115]。SDC4可以通过激活Ras超家族(Ras superfamily)GTP酶ADP核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor6，ARF6)，参与细胞膜的运输、肌动蛋白细胞骨架重塑以及细胞运动，来影响整合素复合物在Focal adhesion位点的组装和分解[116-117]。SDC4通过调节ARF6蛋白的表达，从而改变细胞膜上肌动蛋白的分布，促进细胞的运动。此外，SDC4还可以激活ARF6的活性，从而调节细胞膜上肌动蛋白的合成和释放以及肌动蛋白细胞骨架的重塑。
SDC4除了有促进Focal adhesion的形成作用之外，还可以通过介导蛋白激酶C-α(protein kinase C-α，PKC-α)的激活来调控整合素β1的内吞作用，从而调节Focal adhesion的信号传导[118]。SDC4还可激活ADP核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6，ARF6)，这是一种Ras超家族GTP酶，主要参与膜运输、肌动蛋白细胞骨架重塑和细胞运动，来影响整合素复合物在Focal adhesion位点的组装和分解[119-120]。许多体外试验表明，干扰SDC4的表达可以减少Focaladhesion形成，降低细胞扩散。相反，过表达SDC4则会促了细胞的扩散，并形成更大、更多的Focal adhesion。由此可见，体外细胞培养过程中SDC4在细胞黏附过程中发挥着重要的作用。本研究认为该蛋白可能是影响Vero细胞胞间黏附功能的靶基因，敲低贴壁细胞中该基因构建相应工程细胞株，通过驯化有可能获得悬浮培养Vero细胞。
第五章全文结论
1.转录组学分析悬浮型和贴壁型Vero细胞中共鉴定获得3617个差异表达基因(DGEs)，在悬浮型细胞中2100个上调，1517个下调。进一步筛选获得15个与细胞黏附相关DEGs：多配体蛋白聚糖-4(SDC4)、肌动蛋白调节器(ENAH)、肌球蛋白轻链12β(MYL12β)、肌球蛋白轻链激酶(MYLK)、密封蛋白(OCLN)、IV胶原蛋白基因α1(COL4α1)、肌球蛋白重链9(MYH9)、细胞表皮生长因子受体(EGFR)、含IQ结构的GTP酶激活蛋白2(IQGAP2)、细胞分裂因子4(DOCK4)、整合素β2蛋白(ITGβ2)、转化生长因子β受体1(TGFβR1)、神经细胞黏附分子1(NCAM1)、整合素相关蛋白(CD47)、凝溶胶蛋白(GSN)。qRT-PCR验证表明SDC4、ENAH、MYL12β、MYLK、OCLN、COL4α1、MYH9和EGFR 8个基因在悬浮型Vero中mRNA表达量水平显著下调，GSN、DOCK4和ITGβ2 3个基因mRNA表达量水平显著上调，与转录组学检测结果一致。
2.蛋白质组学分析，悬浮型Vero细胞中存在190个显著性差异表达蛋白，其中116个表达量上调，74个表达量下调。蛋白功能聚类分析显示这些蛋白主要参与分子代谢等过程，分布于细胞表面、肌动蛋白细胞骨架等，涉及肌动蛋白结合、细胞形态调节、黏附等功能。根据黏附功能、表达量差异和亚细胞群定位三个条件共筛选出15种与细胞黏附功能相关蛋白。Western blot检测表明ENAH、TGFβR1和SDC4在悬浮型Vero细胞中表达量显著下调，而OCLN、DOCK4和MYLK表达量显著上调。
3.运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建获得敲低SDC4细胞系Vero-SDC4-KD。
4.运用慢病毒转导技术构建获得稳定过表达ITGβ2细胞系Vero-ITGβ2。
参考文献（略）
