医学论文哪里有？本研究成功分离到了小鼠原代脑微血管内皮细胞（BMEC）和星形胶质细胞（AS）两种细胞，细胞纯度均可达 90%以上。
第一章 文献综述
1.4 粪肠球菌毒力基因研究进展
毒力基因能直接而影响细菌对机体的毒力以及感染力，粪肠球菌作为致病菌可以引起很多动物疾病（如：鸡、鸟、猪、牛、人类等），在致病过程中粪肠球菌能够产生、分泌多种毒力因子（如：溶血素、蛋白明胶酶、溶细胞素等）。
1.4.1 细胞溶血素
细胞溶血素（细胞溶素，cytolysin, cyl），作为一种细菌毒素，能对多种细胞产生毒性及损伤，如红细胞、中性粒细胞、精子、血小板等[37]。在医院粪便样本中分离的粪肠球菌、临床疾病中粪肠球菌的cyl 基因检出率在50%以上[38-40]，而从环境中分离出的粪肠球菌对cyl 基因的检出率不超过20.0%[38]。不同地区鸡源粪肠球菌中cyl 基因的检出率差别极大，检出率从3.0%~20.0%不等[41, 42]；Özkan Aslantaş[43]也曾在具有万古霉素抗性的粪肠球菌中也曾检出过cyl 基因；通过对多种由粪肠球菌引起的临床病例分析后，发现cyl 基因与细菌的致死率有很大关系，其中具有庆大霉素/卡那霉素耐药能力的细菌会更容易引起患者/患病家畜的预后不良[44]。鼠类杀伤力测试表明，表达cyl 基因的粪肠球菌菌株比同基因的非溶细胞菌株毒性高一个数量级。同样，由cyl 基因操纵子中的Tn917插入衍生的高溶胞菌株导致毒性进一步增加了两倍。其他人使用不同的肠球菌菌株证实，cyl 基因可导致50％致死剂量（LD50）增加一个或多个数量级[45]。表达cyl 基因的金黄色葡萄球菌能够导致宿主弥漫性血管内凝血和肝损伤[46]。单核细胞增生李斯特菌中，含有溶血素 LLO 的 PEST 序列协同宿主内吞机制，能保持宿主质膜的完整性，使细菌在宿主细胞胞浆中生长[47]。
第三章 致脑膜炎粪肠球菌全基因组噬菌体随机展示文库的构建
3.1 材料
3.1.1 菌株和质粒
致脑膜炎粪肠球菌由本实验室前期分离并保存；TG1大肠杆菌； M13辅助噬菌体；辅助载体pComb3xss购自上海武竟科技有限公司。
噬菌体展示技术是一种将基因型和蛋白表型相联系，进行配体筛选的技术，丝状噬菌体其自身为一种分泌蛋白，因此通常将目的基因碎片插入噬菌体特定基因中，在胞浆内可依赖于信号肽途径折叠并转运到细胞质表面，借此在噬菌体衣壳蛋白上进行表达，将基因型和表型相对应关联，噬菌体表面所展示的蛋白将会按照其自身的位置进行折叠，从而具有了该蛋白所固有的生物活性。本研究利用噬菌体展示技术构建致脑膜炎粪肠球菌全基因组随机展示文库，从而筛选致脑膜炎粪肠球菌引起脑膜炎、突破血脑屏障的相关因子。
第四章 基于噬菌体展示文库的血脑屏障相关毒力因子筛选
4.1 材料
4.1.1 实验材料
噬菌体文库筛选方法中的体外细胞筛选法，常用于鉴定与原代细胞特异性结合的多种肽，可在贴壁细胞上进行。优点是能保留靶标的生物学功能和活性，也可以使用改进后的筛选步骤分离进入细胞内的肽。重要的是，体外细胞生物淘选可鉴定出生物学功能未知的新型细胞表面受体，可用于提供有关特定分子变化的信息。
致脑膜炎粪肠球菌由羔羊脑膜炎病例中分离，在小鼠回归实验中同样能够引起小鼠脑膜炎[202]，并通过研究证明该细菌能够破坏小鼠BBB中的紧密连接，使BBB通透性发生改变[203, 204]，能引起体外小鼠BBB模型中MMP-2基因上调。本研究在前两章构建的小鼠体外BBB模型和致脑膜炎粪肠球菌全基因组噬菌体随机展示文库的基础上，对粪肠球菌引起脑膜炎、突破BBB过程中发挥作用的相关分子进行筛选。
4.2 方法
4.2.1 噬菌体的亲和筛选
以构建的小鼠体外BBB模型中的细胞为靶标细胞，参照噬菌体随机肽库的使用说明书，按照相应的筛选方法，进行 3 轮筛选。筛选过程如表4-3。
全文结论
本研究成功分离到了小鼠原代脑微血管内皮细胞（BMEC）和星形胶质细胞（AS）两种细胞，细胞纯度均可达 90%以上。
在Transwell结构的基础上成功构建小鼠的体外血脑屏障（BBB）共培养模型，并以荧光素钠和4h渗透试验对体外模型进行了验证，文库容量为2.7×104。
通过超声破碎粪肠球菌全基因组得到 300~3000b DNA 片段，构建粪肠球菌全基因组随机展示文库，选择毒力基因不同的粪肠球菌作用于体外BBB模型后，引起BBB模型通透性发生改变。以BBB模型中脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞为靶细胞，与构建的体外BBB作用，通过亲和筛选、富集、扩增后，对结果的测序及Blast比对，共得到 7 种粪肠球菌基因，分别为透明质酸酶，溶血素，胶原粘附蛋白，表面锚定蛋白，明胶酶样蛋白酶，RNA聚合酶，表面蛋白。
参考文献（略）
