医学论文哪里有？笔者经过研究，得出以下结论：（1）Muse 细胞可以从骨髓中分离，通过贴壁-悬浮-贴壁的培养方式，能更高效地获取 Muse 细胞。（2）Muse 细胞能较 BMSCs 更有效地促使炎症环境中小胶质细胞向 M2 型转变，增加 M2 型小胶质细胞的表达并减少 M1 型细胞的存在比例，通过调节小胶质细胞的表型从而改善炎症微环境。
第一章 绪论
1.1.3 Muse 细胞目前的研究进展
多系分化持续应激细胞（multilineage differentiating stress enduring cell，Muse cell）是 2010 年由 Yasumasa Kuroda 发现的一种多能干细胞，是骨髓内源性修复干细胞，约占骨髓腔内单核细胞总数 0.03%，可从真皮组织、脂肪组织以及间充质组织中获取，来源丰富[31]。Muse 细胞高表达 SSEA-3 和 CD105，具有应激耐受性、自我更新能力、干细胞成球性以及向三胚层分化的能力[32]，且植入体内不致瘤，不发生免疫排斥[33]，提示其安全性高，为干细胞移植相关研究带来新的思路。
Muse 细胞目前颇受国内外研究者的关注。从 2018 年起，Muse 细胞已在临床试验中被应用到中风、SCI 等疾病中[34]。研究发现 Muse 细胞具有如下优势：（1）归巢特性。当静脉注射 Muse 细胞时，Muse 细胞也能准确到达损伤部位。当使用 S1PR2 拮抗剂时，Muse 细胞的归巢特性被大大降低，提示这种特性由 S1P-S1PR2 轴介导[35]。与 MSCs 中的非 Muse 细胞部分相比，Muse 细胞的归巢能力更强[35]。（2）细胞移植存活率高。在 3d 时，Muse 细胞在急性心肌梗死模型中的存活率约为 14.5％，大大优于 MSCs（存活率很低接近于 0）。静脉输入的 Muse 细胞在向损伤的肺、脾迁移 2 w 以后仍保持高细胞数量水平，而 MSCs 中的非 Muse 细胞部分则大量消失甚至完全消失[35]。（3）免疫调节功能。Muse 细胞分泌的 HLA-G 使其能够获得免疫耐受能力，并降低宿主环境中炎症表达的水平[36]。另外，Muse 细胞还能分泌大量 TGF-β1，通过 TGF-β1/SMAD 信号通路从而下调巨噬细胞促炎因子的表达[37]。有研究表明，Muse 细胞在肠道炎症环境中可以下调γ-干扰素（interferon γ，IFN-γ）和 TNF-α的分泌水平，并上调 IL-10，且其抗炎功能优于 BMSCs[38]。目前，人们对 Muse 细胞的抗炎机制了解的并不清楚，对于 Muse 细胞如何发挥具体的抗炎效果，还需要进一步探索。
综上所述，Muse 细胞在细胞移植中具备巨大潜力，非常值得研究。
第三章 Muse细胞改善炎症微环境并调节M1/M2型小胶质细胞比例
3.1 实验材料
3.1.1 实验试剂与耗材
SCI 后的炎症反应阻止了 SCI 神经功能的修复，炎症反应带来的继发性不良损害长期困扰着 SCI 患者，成为 SCI 患者病情加重甚至死亡的主要原因之一。而小胶质细胞则是 SCI 后炎症微环境中至关重要的免疫细胞，它们调控周围细胞的功能并影响损伤的发展进程。Muse 细胞已经在多种疾病模型中被证明具有抗炎作用，且已被应用在 SCI 的临床治疗当中，但 Muse 细胞在以小胶质细胞为主的神经炎症中的作用还未有报道。
为了探讨 Muse 细胞对神经炎症微环境中的小胶质细胞的影响，我们将 Muse 细胞与原代大鼠小胶质细胞或大鼠小胶质细胞系 HAPI 细胞通过 Transwell 皿进行共培养，在光镜下观察小胶质细胞的形态变化情况，使用 qRT-PCR 的方法检测小胶质细胞炎症相关因子的 mRNA 合成，用 ELISA 法检测小胶质细胞促炎因子与抗炎因子的分泌水平，用 CCK-8 的方法检测干细胞直接接触培养时小胶质细胞的活力，最后结合流式细胞术、qRT-PCR 以及 Western Blot 法探究 M1/M2 型小胶质细胞比例。
第四章 Muse细胞调节炎症微环境的机制探讨
4.1 实验材料
4.1.1 实验试剂与耗材
目前人们发现，M1 型小胶质细胞主要通过激活 NF-κB 与 MAPK 通路发挥促炎作用[89]。TLR4 是一种受体，广泛表达于神经胶质细胞和神经元等细胞中。SCI 发生后，组织与细胞会释放一系列 DAMPs。这些物质都是 TLR4 的内源性配体，与 TLR4 结合后，下游信号配体 MyD88 依赖的通路就会激活 NF-κB，促使 TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子释放，导致炎症反应[90]。相似的是，MAPK 家族也是参与 SCI 炎症反应的关键信号分子[91]。在 MAPK 家族中，ERK 主要调控细胞生长和分化，JNK 与 p38 MAPK 则在炎症的调控与细胞凋亡中发挥重要作用。当 p38 MAPK 被激活，其会调节下游 HSP27、p53、MK2 等分子从而进一步激活细胞核内的炎症反应。
前期研究中为模拟神经炎症微环境而使用的 LPS 也是TLR4 的配体之一[92（]图 4-1），因此，为了进一步探究 Muse 细胞是否通过抑制 TLR4 介导的 NF-κB 通路与 MAPK 通路实现对小胶质细胞炎症的调节，我们将 Muse 细胞与原代小胶质细胞在含 LPS 的培养基中共培养 2 h，通过 Western Blot 检测小胶质细胞 NF-κB 与 MAPK 信号通路中关键蛋白TLR4、MyD88 的表达情况与 p65、IκBα、ERK、JNK、p38 的磷酸化蛋白水平。
4.2 实验方法
4.2.1 Muse 细胞与原代小胶质细胞共培养
实验分为 Sham 组，Muse co-culture 组，LPS 组与 Muse co-culture + LPS 组，各组细胞均使用 DMEM/F12 基础培养基培养。
Sham 组为培养 2 h 的原代小胶质细胞；Muse co-culture 组是将 Muse 细胞与原代小胶质细胞共培养 2 h；LPS 组是在培养基中添加 1 μg/ml LPS 培养 2 h 的原代小胶质细胞；Muse co-culture + LPS 组是将 Muse 细胞与原代小胶质细胞在含 1 μg/ml LPS 的培养基中共培养 2 h。Muse 细胞与原代小胶质细胞共培养的操作步骤与 3.2.3.2 一致。
4.2.2 Western Blot 检测小胶质细胞内通路蛋白的表达
4.2.2.1 细胞总蛋白的提取
同 3.2.8.1 一致。
4.2.2.2 BCA 法进行蛋白定量
同 3.2.8.2 一致。
4.2.2.3 SDS-PAGE 电泳
（1）上样：将样品取出，100 ℃金属浴中煮 5 min，将 10 % PAGE 预制胶置于电泳槽内，每孔上样量为 40 μg；（2）电泳：120V 恒压 80 min；
4.2.2.4 转膜
（1）在﹣80℃中预冷转膜液，用无水甲醇活化 PVDF 膜 1 min；（2）在搪瓷盘中加入转膜液，铺好三明治夹；（3）将制好的三明治夹置于转移槽中，加入小冰块，转移置盛有碎冰的盆中，250mA 恒流 1.5 h；
主要结论与展望
展望
本实验探讨了 Muse 细胞可能通过抑制小胶质细胞内的 TLR4/MyD88/NF-κB 与 p38MAPK 信号通路降低炎症环境下小胶质细胞的炎症反应，并让其向 M2 型细胞转变。Muse 细胞的抗炎能力较 BMSCs 更强，提示 Muse 细胞在 SCI 的治疗中具有强大的潜力，但仍然有许多问题值得深入探究：
（1）Muse 细胞抗炎的具体通路机制。由于处于 Transwell 培养皿上室的 Muse 细胞通过旁分泌作用调节小胶质细胞的免疫功能，因此，对于在 Muse 细胞抗炎功能中发挥主要作用的分泌物还需要进一步研究。Muse 细胞在抗炎过程中发挥主要作用的信号通路也需要进一步验证。由于目前对于 Muse 细胞抗炎机制的研究较少，深入研究其免疫功能可以为 Muse 细胞应用于各种类型疾病提供有力依据。
（2）Muse 细胞较 BMSCs 在抗炎功能中的具体优势。我们发现在 Transwell 共培养体系中，Muse 细胞对小胶质细胞的抗炎效果优于 BMSCs，但 Muse 细胞与 BMSCs 相比，抗炎因子的合成与表达具体优势在何处尚未可知，需要进一步研究。
（3）结合实验动物与细胞示踪技术研究 Muse 细胞在 SCI 动物炎症模型中的作用及机制，可以更好的阐述 Muse 细胞在 SCI 疾病中发挥的效果。
参考文献（略）
