医学论文哪里有？笔者经过研究，得出以下结论：NDV 强毒感染鸡巨噬细胞细胞后通过下调宿主 gga-novel-217-5p 的表达，导致其靶基因 TAB1 的表达水平上调，进而促进 IκB-α 磷酸化来激活 NF-κB 信号通路，最终导致更高水平的细胞因子表达。
第一章 新城疫与新城疫病毒
1.1 新城疫
新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）强毒株感染引起的一种禽类高度接触性传染病，主要能导致易感禽类出现呼吸困难、神经紊乱以及黏膜和浆膜的出血等临床症状[13, 14]，影响超过 250 种鸟类，每年给全球养禽业造成巨大的经济损失[15]。因致病毒株和宿主的差异，ND 可表现出不同严重程度的疾病症状和病理学变化[16]。当前 ND 被世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）列为必报动物疫病[17]，属于我国农业农村部和海关总署动物疫病名录中一类动物疫病，同时也是十三五《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020 年）》和十四五期间需要持续重点防治的国内重大动物疫病[18]。
ND 自 1926 年首次在印度尼西亚被报道后，次年英国新城爆发 ND 疫情，随后菲律宾、印度、日本、澳大利亚、巴勒斯坦、叙利亚、西西里岛、欧洲和美国等均有报道。20 世纪 60 年代，作为第二次和第三次 ND 全球大流行的一部分，夏威夷、加拿大、墨西哥、中南美洲和整个欧洲也被陆续报道出 ND 疫情。
自 1946 年 NDV 首次在我国被分离以来，ND 流行至今已有 70 余年[19]。过去普遍认为水禽对 ND 具有较强的抵抗力，尽管水禽群中有 NDV 的潜伏，却不会使水禽出现致病的明显症状。但随着水禽源 ND 疫情暴发数量日益增加[20]，ND 突破陆生禽范围，向水禽等宿主不断扩大，进而对养禽业的危害也日益加剧。根据不同毒力 NDV 感染禽类后致病性及致死率的不同，可将 ND 分为三种类型，分别是缓发型、中发型和速发型。其中，缓发型和中发型 ND 往往只引起鸡成长速度变慢、瘦弱和蛋鸡产蛋率降低，而速发型 ND 可对家禽的致死率达到 100%，对养禽业造成巨大的经济损失[21, 22]。值得注意的是，近年来由于疫苗免疫程序不合理或存在其他免疫抑制性疾病共感染等原因，常常会在免疫鸡群中发生非典型 ND[23]，导致 NDV 感染从原来的典型症状转为典型与非典型并存的症状。非典型的 ND 主要表现为呼吸系统的疾病以及神经临床症状，有时还表现为产蛋鸡的产蛋率下降，但其所引发的发病率和致死率均比较低[24, 25]。
第二章 新城疫病毒强毒感染鸡巨噬细胞过程中关键 miRNA的筛选及其靶基因的验证
2.1 实验材料
目前，已经有大量的研究证实了细胞 miRNA 能够通过多种机制调节病毒的感染、复制以及致病性。Cheng Du 等人提出，马传染性贫血病毒强、弱毒感染后会对靶细胞生物学功能造成不同的影响，其原因是调控分子发生不同程度的改变，而 miRNA 作为常见的调控分子在其中也发挥着至关重要的作用，宿主细胞编码的 miRNA 可通过调控自身或病毒基因的表达而对抗病毒感染[88]。但是关于宿主 miRNA 在 NDV 强、弱毒感染过程中发挥的角色还未见报道。
为探索 NDV 强、弱毒感染过程中差异表达 miRNA 的功能，本章将以miRNA 的靶基因是否参与病毒感染或免疫过程作为筛选条件，从上一章得到的NDV 强、弱毒感染后持续差异表达的 33 个 miRNA 中筛选出潜在的功能性miRNA ，并通过 qPCR 、细胞转染等技术手段来验证筛选出的潜在功能性miRNA 及其预测靶基因的靶向关系。
新城疫病毒强毒分离株 JL2 和弱毒分离株 F55（GenBank：KT892749）由本实验室鉴定、保存。
其它实验材料与论文 1.1 内容相同。
第三章 新城疫病毒强毒感染鸡巨噬细胞过程中关键 miRNA的功能分析
3.1 实验方法
3.1.1 引物设计及合成
本章用到的所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表3.1 所示。
3.1.2NDV 感染 HD11 细胞和 Total RNA 提取
与论文 1.2.1.1 和 1.2.1.3 内容相同。
3.1.3磷酸化 IκB-α 的 ELISA 检测
（1）待 6 孔板中 HD11 细胞的聚合度约为 60%后，对细胞转染 gga-novel-217-5p 的 mimic 及 inhibitor，方法与 2.2.6 内容相同； （2）转染 12 h 后，用 PBS 反复清洗 3 次，随后反复冻融，以使细胞破坏并释放出细胞内成份，以 2000 rpm/min 离心 20 min 后，收集上清； （3）设置标准品孔、样品孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，待测样品孔中先加入 40 μL 样品稀释液，再加入待测样品 10 μL，轻轻晃动混匀； （4）加酶：每孔加入 100 μL 酶标试剂，空白孔除外； （5）温育：用封板膜封板后，放置 37℃，温育 60 min； （6）洗涤：将封板膜小心撕掉，弃去孔中液体，甩干，随后每孔加满洗涤液，静置 30 s 后弃去，步骤重复 5 次后将板中液体拍干； （7）显色：每孔先加入显色剂 A 50 μL，再加入显色剂 B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15 min；
3.2结果
3.2.1 NDV 强、弱毒感染后差异诱导鸡巨噬细胞中细胞因子的表达水平
在不同毒力病原微生物感染进程中，强毒感染往往会诱导机体和细胞水平产生更高水平细胞因子的表达[96, 97]。因此，我们选择 NDV 强毒 NA-1 和弱毒LaS ota 感染 HD11 细胞，对感染后 IL-1β、iNOS、TNF-α 和 IFN-α 的表达量进行检测。结果如图 3.1 所示，与 Pingze Zhang 对 NDV 强毒感染鸡巨噬细胞诱导细胞因子水平变化的结果一致[98]，与未感染组相比，NA-1 感染 24 h、48 h 后IL-1β 和 TNF-α 的表达量都呈显著上升的趋势，iNOS 和 IFN-α 的表达量只在NA-1 感染 48 h 后呈显著上升趋势；而 LaS ota 感染 24 h 和 48 h 后细胞因子的表达水平均与未感染组无明显差异。通过这些数据，我们发现相比于 NDV 弱毒LaS ota 感染组，强毒 NA-1 感染 48 h 后能诱导更高水平的细胞因子表达。
为鉴定筛选的 gga-novel-217-5p 能否参与 NDV 强、弱毒差异感染过程，转染 gga-novel-217-5p 的 mimic、inhibitor 和 NC 后，检测细胞内的 IL-1β、iNOS、TNF-α 和 IFN-α 的表达量。结果如图 3.2 所示，与转染 NC 组相比，IL-1β、iN OS、TNF-α 和 IFN-α 的 inhibitor 组表达水平显著升高，而 mimic 组的表达水平显著降低，说明人为改变 gga-novel-217-5p 的表达量能够影响鸡巨噬细胞中细胞因子的表达水平。
结论
1、与 NDV 弱毒 LaS ota 感染组相比，强毒 NA-1 感染后有 33 个 miRNA 持续性差异表达，从中共筛选出 12 个与病毒感染或免疫相关的 miRNA，其中只有 gga-novel-217-5p 的表达量在 NDV 强毒感染后显著下调，而在弱毒感染后无明显变化。
2、NDV 强毒感染鸡巨噬细胞细胞后通过下调宿主 gga-novel-217-5p 的表达，导致其靶基因 TAB1 的表达水平上调，进而促进 IκB-α 磷酸化来激活 NF-κB 信号通路，最终导致更高水平的细胞因子表达。
参考文献（略）
