本文是医学论文，头穴围刺通过对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，促进血管新生相关蛋白的表达，从而促进血管新生，降低脑梗死大鼠损伤程度。在实验一研究中，首先成功制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注脑梗死模型，在造模成功后，可出现提尾悬吊时，右前肢屈曲，爬行时向右侧转圈，向右侧倾倒等，与临床中脑梗死患者症状极为相似。给予头穴围刺治疗7天后神经功能缺损程度改善，较模型组mNSS评分降低，在治疗后14天和21天后头穴围刺评分均明显降低（P＜0.01），差异具有统计学意义。证明了头穴围刺可以降低神经功能缺损程度。这与课题组前期研究结果[123]和国内同类研究结果[124]类似。同时，我们采用HE染色方法，观察MCAO大鼠脑梗死组织病理形态学。为了进一步验证HE染色所见增多的微血管以及缩小的脑梗死体积与梗死组织内的新生血管带来增多的血液灌注量有关，我们进一步采用激光多普勒血流仪检测各时间点大鼠实验前后脑缺血区皮质血流量（rCBF）。这可能是针刺组大鼠mNSS评分明显降低的内在组织学基础。我们在HE染色的基础上进行造模后脑组织TTC染色，在7天、14天、21天三个点，观察脑梗死体积的变化，发现针刺组内相比较，随着针刺治疗时间的延长，脑梗死体积明显缩小，说明头穴围刺可以减小脑梗死体积。
.......
前言
临床研究表明，头穴围刺可以减轻神经功能缺损程度，提高日常生活能力评分，降低残障程度[9]。然而是否能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白，上调血管新生相关因子表达，从而促进脑梗死区血管新生，帮助神经功能恢复，其可能的机制尚有待进一步阐明。本研究在黑龙江省自然科学基金联合引导项目（LH2019H105）和黑龙江省自然科学基金青年基金项目（QC2018114）支持下，建立大鼠大脑中动脉栓塞模型，采用mNSS评分观察头穴围刺对MCAO大鼠神经功能的影响，采用TTC染色观察各组大鼠脑梗死体积，采用激光多普勒血流仪检测头穴围刺对大鼠脑缺血区皮质血流量（rCBF）的影响，采用HE染色检测各组大鼠脑梗死区组织损伤情况及微血管状态；采用免疫组化法检测各组脑梗死组织中Wnt3a、β-catenin、TCF4、CyclinD1、GSK-3β、VEGF、Ang2、FLK1、bFGF的表达；Westernblot法检测各组脑梗死组织中Wnt3a、β-catenin、TCF4、CyclinD1、GSK-3β、VEGF、Ang2、FLK1、bFGF蛋白表达，采用RC-PCR检测各组Wnt3a、β-catenin、TCF4、CyclinD1、GSK-3β、VEGF、Ang2、FLK1、bFGFmRNA表达，揭示头穴围刺是否通过改善脑梗死区血液供应状态促进其神经功能恢复，阐明头穴围刺是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路上调血管新生相关因子表达，促进脑梗死区血管新生，从而降低脑梗死大鼠神经功能损伤程度。前言脑梗死（cerebralinfarction，CI）属于缺血性脑卒中，是由各种不同致病因素导致的脑组织局部血供中断或部分中断，导致脑组织缺血缺氧的一种脑血液循环障碍性疾病，临床上患者虽然能够被及时救治，但往往遗留有严重运动功能障碍、认知功能障碍及感觉功能障碍，日常生活功能下降，极大地降低了生活质量[1]。中国脑卒中发病率在全球位居前列，且呈现逐年增加、逐年低龄化趋势[2]。
.........
文献综述
1中医学对脑梗死的认识
韩林等[50]发现醒脑开窍针法干预脑缺血大鼠后大脑梗死灶明显缩小。细胞电生理研究被后来学者广泛应用于研究针刺对抗脑缺血作用中[51]，从海马组织KATP通道着手研究神经元兴奋性和神经自我保护机制证明了醒脑开窍针法具有减轻神经损伤功能。脑梗死病位在脑，针刺头部腧穴体现了腧穴的近治作用，因此头部针刺治疗脑部缺血性疾病被临床上广泛应用并且取得了良好的效果。姚小强等[52]头穴透刺即针刺双侧顶颞前斜线抑制白细胞介素(IL)-1β表达，同时上调了大鼠纹状体区正五聚环蛋白（PTX）3表达水平，从而直接或间接上调闭锁小环蛋白（ZO）-1、咬合蛋白OccludinmRNA表达，维护神经血管单元的完整性，改善神经功能缺损，可以治疗急性缺血性中风。田嘉琦等[53]实验表明，头穴丛刺疗法可以使缺血脑组织中的脑源性神经营养因子（BDNF）的蛋白及其基因表达水平上调、和使神经营养素受体p75(p75NTR)的蛋白与基因表达水平下调，可以通过此途径起到脑组织的神经保护效应。多数学者认为缺血是动态发展过程，在有效时间窗内恢复血流状态促进血液再通可帮助恢复神经功能。所有缺血脑卒中治疗的目的都是为了恢复缺血半暗带的血流量，减少最终核心梗死区域面积。研究发现[68]，血管内存在着Wnt蛋白，它参与到脑血管生成的过程中，是重要调控介质，成体或胚胎血管生成可以通过调控Wnt信号通路来进行。因而，现在在治疗缺血性脑卒中方面，通过调控Wnt信号通路上的蛋白来增加血管新生已成为研究热点。
各组大鼠神经功能评分
2针刺促进脑梗死后血管新生的研究进展
因此，治疗缺血性脑卒中方面的潜在靶点也可是血管新生，同时也证明刺激血管新生不失为治疗缺血性脑卒中的有效方法。血管生成和血管发生是成体血管在出生后再次形成的两种途径。已经存在的血管中现有的内皮细胞通过激活，冲破管壁基层，增殖、迁移以及重构，最后出芽而长成新的血管网络，为组织和器官输送氧气或提供营养，称为血管新生。以上是发育和生长的正常生理过程，也是在组织缺血损伤后机体的正常应激反应。而血管发生则不同，它是完全的血管新生的途径，机体在某组织损伤后，在外源性和内源性的作用下，在一定时间内许多诱导因子以间接或直接的方式在损伤部位附近释放，骨髓内的内皮祖细胞（EPCs）作为血管新生的关键因子，在缺血初期从骨髓内被转移到外周血中，完成迁移、增殖、分化等步骤，之后血管内皮关键因子(VEGF)及其受体被激活表达水平上升共同完成血管新生。血管细胞可经此通路对Wnt的信号作出反应，血管新生受多条信号通路调控，但是Wnt/β－catenin信号通路具有直接调控血管新生的作用，该信号通路在血管重塑、血管生成和促进分化等方面均有涉足；还包括血管的出芽，血管网的成熟[69]。经典Wnt通路关键因子是β-catenin，当缺血后会激活Wnt配体，刺激血管中存在的Wnt蛋白，与相应的受体结合，阻断GSK-3β对β-catenin的磷酸化作用，使细胞质内β-catenin进入细胞核，与转运蛋白结合作用于相应的靶基因，血管内皮细胞的表达增多，可增加新生血管数量。
实验中大鼠脑梗死缺血半暗区取样方法
实验三头穴围刺对大鼠脑梗死区血管新生的影响..........................................53
1实验材料.................................................................................................................53
2实验方法.................................................................................................................53
讨论......................................................................................................62
1脑梗死大鼠损伤模型的选择...........................................................................62
2脑梗死病灶标本的选择.....................................................................................63
3穴位及针刺方法的选则.....................................................................................64
4针刺时间及观测时间点的选择.......................................................................65
5激光多普勒血流监测仪观察指标的选择....................................................66
6Wnt信号通路相关指标及抑制剂的选择......................................................67
7血管新生相关指标的选择................................................................................68
8实验结果讨论分析..............................................................................................69
结论...................................................................................................72
........
讨论
1脑梗死大鼠损伤模型的选择
本实验选择的是缺血1.5小时后再灌注的左侧大脑中动脉线栓法制备的大鼠脑梗死模型。线栓法造模的优点是不需要开颅，属于相对非侵入的方法。线栓法疗效确定，具有准确控制缺血时间等优势，由线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型，目前被学者公认是较为理想的局灶性脑缺血模型，可用于脑血管疾病的基础与临床研究[76]。因此，本实验选择技术成熟的Zealonga线栓法[71]进行脑缺血造模。本实验线栓进线位置选择的是颈外动脉切口，经过预实验证明这种进栓位置造模后成功率更高，模型更可靠，更适合较长时间观察。这与王东亮等学者研究结果[77]一致。本实验造模时选择的是右利雄性大鼠左侧栓塞造模，参照高焕民等[78]研究结果，认为右利雄性大鼠左侧栓塞造模脑缺血模型可重复性好，安全性高，造模成功率高，这与之前预实验结果相一致。本实验在线栓的选择上，采用了硅胶涂层的线栓，有实验[79]表明硅涂层尼龙线栓组大鼠具有更严重的神经功能缺损及更大的梗死体积，提示由硅涂层线栓制作的脑缺血模型更加可靠稳定。对于线栓长度的选择，通过预试验反复测算17-20mm的线栓，发现线栓越长造模成功率越高，但是线栓超过22mm则动物存活率下降，因此本实验选用20mm线栓，这与温学花等[80]研究的成年SD大鼠线栓法MCAO模型结果一直，栓线插入越深，脑梗死体积越大，动物存活率越低，越易累及皮层；深度20mm更适用于建立梗死灶较稳定且动物存活率较高的实验性大鼠缺血脑损伤模型。栓塞时间的选择，经过查阅相关文献目前对于缺血再灌注造模形成梗死灶的时间多有两种：1.5h和2h。结合预实验结果本实验最终选择缺血后1.5h再进行灌注。有研究报道[81]显示缺血1.5h再灌注大鼠与缺血2h再灌注大鼠均有较大的梗死体积，均有神经功能缺损，但是2h再灌注大鼠有更大的梗死体积及更严重的神经功能缺损，提示两种脑缺血大鼠模型均可以用作未来脑卒中探索性研究的理想动物模型。
2脑梗死病灶标本的选择
本实验标本取样选择的是大脑中动脉支配区的缺血半暗带区，实验发现由于梗死灶中心缺血时间长，血管破坏严重，而周围的缺血半暗带区血管未完全坏死血流缺失处于半休眠状态，针灸刺激后能够快速地建立血运形成新的血管网。其与部分学者研究结果相同，贾蓝羽等[83]在采用电针针刺水沟穴观察其对脑梗死后血管新生的影响，实验发现，若留取右侧大脑中动脉供血区脑组织，随缺血时间的延长，血管新生标记物CD31与Ki67的共表达自梗死侧边缘开始向梗死侧移行发展，在部分脑表面的软脑膜毛细血管亦观察到Ki67的表达。说明血管新生随着时间的推移从缺血半暗带开始逐渐向缺血核心区域发展。Marti[84]的研究表明血管新生可能源于梗死侧边缘和大脑表面的软脑膜血管。因此，本实验对于脑梗死病灶标本的选择尽可能包括大脑中动脉支配的皮层及向梗死核心区域移行区即缺血半暗带区。在确定取样具体部位时，我们通过对文献检索，选择最为广泛使用的Ashwal法[85]将大鼠脑组织切成三片，从额叶的前尖端开始2mm处向后测量4mm，冠状切片，取4mm的切片用于检测，确定4mm的切片的两个半球之间中心线，也就是大鼠脑组织的纵向中线，然后从中线向梗死侧测量2mm，进行纵向切割，这样是为了排除由大脑前动脉供血的中脑半球结构，然后将切片的断面看成一个钟面，从大约2点和8点之间连线与中线旁开2mm的平行线呈夹角，夹角内的部分就是取样区。在2点和8点之间进行连线是排除了皮质下结构包括横向的尾状核、壳核和覆盖的皮质，包括纹状体和附近的皮层，腹外侧皮层。见图（26）。
.........
结论
结果表明，模型组大鼠脑组织疏松明显，结构混乱，形态不规则，神经细胞数目减少，排列不清，周围疏松肿胀，可见胞浆淡染，胞核溶解，微血管管腔明显变形，甚至塌陷，直至21天略有改善但并不明显；针刺组大鼠脑组织病理改变整体上较模型组明显，梗死灶周围神经细胞数量增多，结构和形态较模型组大鼠规则，排布趋势较模型组紧致，微血管管腔变形较少，微血管数量较模型组增多，21天针刺组，大鼠脑组织病理改变，整体上较同组7天和14天时改善明显。研究表明[3]，脑缺血损伤可以激活血管内的Wnt信号通路，β-catenin是经典Wnt信号通路中最关键的因子，主要负责Wnt信号的传递，当Wnt通路受到刺激后，Wnt信号通路上的配体Wnt3a蛋白与其跨膜受体及辅助受体结合，激活酪蛋白激酶1ε（CK1ε）使散乱蛋白磷酸化，释放GSK-3β结合蛋白（GBP），GBP将GSK-3β从降解复合物中脱落，从而抑制它对β-catenin的磷酸化，促使β-catenin进入细胞核，与Ｔ细胞因子（TEF）/淋巴增强因子（LEF）家族转录因子TCF4结合，进而启动下游靶基因的转录，促进细胞的增殖与分化。周期蛋白D1(CyclinD1)是细胞周期增殖信号的关键蛋白[4]是β-catenin在细胞核内激活下游靶基因的关键蛋白。而DKK1[5]对Wnt/β-catenin信号通路具有抑制作用，通过与脂蛋白相关蛋白受体6(LRP6)形成复合物，使LRP内化和降解，以此降低LRP和Wnt3a配体的结合率，从而抑制β-catenin被激活。
参考文献（略）
