大黄附子汤不同比例配伍对UUO模型大鼠的作用及机理探究

本文是医学论文，1.大黄附子汤改善UUO模型大鼠的病理状态，减少24h尿蛋白定量、血清肌酐及血清尿素氮水平，改善因输尿管梗阻导致的肾脏病理变化。2.大黄附子汤中大黄与附子2:1配伍最佳。2.本实验通过检测肾间质纤维化大鼠肾功能、肾脏病理以及对Notch/PTEN/Hes1信号通路影响的研究，进而探讨大黄附子汤抗慢性肾衰竭的作用机理。3.本实验首次以多系统、多种实验方法，全面深入分析大黄附子汤抗慢性肾衰竭的作用机理。经过Masson染色后，肾间质纤维组织增生程度对比明显，细胞核呈现红色，基底膜、胶原、细胞外基质可呈现绿色或蓝色。肾小囊基底膜周围纤维组织增生呈现宽厚的蓝染区，主要是由胶原增生而引起。模型组纤维化面积随病变时间的延长逐渐增加，大鼠肾间质胶原相对面积增大，胶原纤维增多，蓝染区面积不断增加。大黄附子汤组、阳性药物组在同时间点上的蓝染区面积均小于模型组，说明大黄附子汤组、阳性药物组肾间质纤维化增生程度、炎性细胞浸润程度均较模型组轻，组织结构较模型组清晰，肾小管排列也较模型组规整

文献综述

薛晓鸥等[79]采用大黄附子汤结合穴位敷贴法治疗原发性痛经，方中重用附子，温里散寒；配伍细辛，助附子辛热之力，可祛寒外出；大黄去性取用，促寒凝消散；共腠温里散寒止痛之功。葛青[80]治疗因寒邪侵犯胞脉,阳气郁阻而致痛经患者，予大黄附子汤加当归、炙甘草。温通散寒，佐活血通络之药，结果腹痛即止，2剂服尽，腹痛未作。唯月经7d不净，再予艾附暖宫丸加减而愈，疗效显著。刘大平[81]应用本方加温经活血调经药物，治疗辨证属阳虚宫寒、胞脉瘀阻的不孕症患者，先水煎内服4剂，待诸症缓解改为丸剂缓缓图之，后足月顺产一男婴。朱文举[82]将慢性盆腔炎患者随机分为两组。其中治疗组（大黄附子汤组）62例，对照组31例（西药组）。结果显示大黄附子汤组总有效率96.8%；对照组总有效率74.2%。两组对比差异显著（P<0.05）。以上均是对大黄附子汤的现代研究，大黄附子汤自古代医家治疗寒积内结、胁下偏痛以来,后世医家根据本方“寒热并用、去性取用、补泄兼施”的配伍特点,将其加减化裁、病证结合，治疗肾病、消化系统、痛证、妇科疾病等，扩大了临床应用范围，疗效显著。在此，我们更应大力研究开发，为临床医治疾病提供更有效的实验和理论基础。大黄与细辛相配，大黄善于攻下浊气内结，细辛善于温阳散寒止痛。附子与细辛配伍长于疏散表寒，止痛，表里兼顾，阳复表解，在内之寒附子温之，细辛助之；在外之寒细辛疏之，附子辅之，共同加强温通肾阳、祛瘀泄浊的功效。全方寒热并用、攻补兼施，既可温补脾肾治其本，又可泄浊排毒化瘀治其标，既无“闭门流寇”之弊，又免伤正之虞。

实验一大黄附子汤对UUO大鼠肾脏功能和形态保护作用的研究

1.材料与方法

本实验选用清洁级（SPF级）雄性SD大鼠60只，实验前体重均为190±10g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（黑）2013-004。实验过程中给予大鼠光照/黑暗各12小时的人工循环。实验室温度与湿度均控制在相对恒定的水平，室内温度为18-25℃，相对湿度40%-75%。实验动物购回后于实验室按常规操作流程给予适应性饲养1周，期间自由进食饮水，隔日更换一次垫料，保持垫料干燥，待大鼠状态良好，再进行造模。大黄附子汤大黄3两（9g），附子3枚（约12g），细辛2两（6g），现临床中多以大黄30g，附子约24g，细辛6g作为大黄附子汤的常用药量。因根据不同症状及中医辨证论治现代临床应用大黄附子汤与其他药物组成方剂时多有药量上的不一。本实验2:1组为24g:12g，1:1组为18g:18g，1:2组为12g:24g，细辛均为6g。药材饮片购自黑龙江中医药大学附属第一医院门诊精品小包装药局。加水10倍量，浸泡30min，加热回流提取2次，每次2小时，旋转蒸发、减压，浓缩，至含生药量1g/ml的浓缩液，按照各组给药剂量进行配置（大鼠模型的给药量均根据临床成人剂量按体表面积折算而成）。厄贝沙坦片（安博维）：购于黑龙江中医药大学附属第一医院门诊西药局，产自Franc赛诺菲（杭州）制药有限公司，进口药品注册证号：H20171182，进口药品分装批准文号：国药准字J20171089，0.15g/片，7片/盒。根据临床成人剂量按体表面积折算，确定每日厄贝沙坦组大鼠给药量为13.5mg/kg。

2.实验结果

初始状态下各组大鼠生长发育正常，皮毛光泽洁净，反应灵敏，活动自如，自然安逸，体重变化正常，排泄物正常。UUO动物在手术后48小时逐步出现精神状态欠佳、活动减少，进食量下降，对外界刺激反应变迟钝。而给予UUO大鼠大黄附子汤干预后，各个比例组大鼠反应水平均有不同程度的改善，食量、尿量、活动度均较好，体重增加较快，宏观表征优于模型组。HE染色的细胞在镜下，细胞核呈蓝紫色，胞浆呈红色。借此可对肾小管上皮细胞出现的损伤情况、间质炎性细胞浸润、水肿以及肾小球结构变化进行评估。本研究中，14天时正常大鼠肾脏组织微观结构清晰，肾小球结构正常，未见硬化肾小球组织，未见系膜细胞与基质增生的情况出现，肾小管结构清晰、无萎缩，肾小管上皮细胞无肿胀和空泡变性的改变，未见肾小管上皮细胞发生刷状缘脱落的情况，肾间质无纤维组织形成及炎性细胞浸润的情况出现。而造模后14天时，可见各组UUO大鼠均见到不同程度的肾小管间质区面积扩大，肾小球基质弥漫性增生，包曼氏囊腔扩张，肾小管上皮细胞肿胀，出现弥漫样空泡变性，可见灶状或片状坏死，肾小管萎缩、部分出现坏死，间质出现多灶状炎细胞浸润伴纤维化发生。并且肾组织损伤程度以模型组大鼠最为严重，大黄附子汤各组与阳性药组大鼠肾脏组织在同时间点与模型组比较，肾小球、肾小管以及间质等病理变化程度均较模型组损伤较轻。

各组大鼠体重变化情况（g）

实验四WesternBlot法检测大黄附子汤对UUO大鼠肾脏Notch1、PTEN、Hes1蛋白表达影响的研究..............................50

1.材料与方法.............................................................................................................50

2.2.实验结果..................................................................................................................54
讨论..................................................................................................................................57
1.大黄附子汤组方配伍意义.................................................................................57
2.动物模型的建立....................................................................................................58
3.实验指标的选择....................................................................................................59
4.对照药物的选择....................................................................................................62
5.大黄附子汤对UUO大鼠肾脏的保护作用...................................................62
6.不足与展望.............................................................................................................65
结论..................................................................................................................................67

讨论

1.大黄附子汤组方配伍意义

中医学中没有慢性肾衰竭这一病名，根据其临床表现、病机、病程，将其归属于中医学“水肿”“尿血”“肾消”等。慢性肾衰竭主要病位在脾、肾，同时与心、肺、肝、三焦等脏腑密切相关。本病的病机，总属“本虚标实，虚实夹杂”。本虚，因七情内伤、劳倦、年老体虚，而致脾肾气虚、脾肾阳虚、肝肾阴虚等；标实，水饮、湿蚀、瘀血，而致水毒潴留、湿浊内壅。在病情发展过程中，脾肾阳虚之病机占有重要的地位。太阴脾为后天之本，主司运化水液和精微，脾阳不足，健运失司，清阳不升而浊阴不降，中焦气机失常，则常见恶心、呕吐、纳差等；脾胃为气血化生之源，脾阳若虚，气血无以化生，故见贫血、低蛋白血症及头晕、疲乏、气短等症；脾主统血，脾阳不足则血液失于统摄，故见血尿及各种出血症状。少阴肾为水脏，元阴元阳内系，肾阳衰弱，气化失司，水湿内盛，开合不利，故见水肿、少尿、无尿或尿量增多；封藏为肾所主，肾阳虚损则肾关失固，精微外漏，故见蛋白尿；脾肾两亏，脾不得升清降浊，肾不得分清泌浊，清浊相干，加之水液代谢失常，痰饮湿浊停留人体而成毒，故见酸中毒、电解质代谢失衡及血肌酐、血尿素等病理产物升高。早中期慢性肾衰竭是中医治疗疗效最佳时期，合理的中医治疗使肾功能全部或部分逆转出现了可能。故方以大黄附子汤温补脾肾之阳兼以祛瘀泄浊之法治疗慢性肾衰竭，取得不错的疗效。其中大黄，荡涤肠胃，祛瘀泄浊；附子辛热，温补肾阳；细辛，除寒以散结。附子温壮阳气，驱散阴寒，善于治疗寒结证，但用之稍有不当，则会出现温热燥化伤津，导致病证由寒结而演化为燥结，因此必须配伍大黄。大黄既可引附子直入病所，又可使附子温热而不燥化，而大黄受附子制约而不助寒，药对相互为用，相互制约。大黄与附子配伍，大黄以泻热，附子以温阳，治疗既有阳虚，又有邪热内蕴。

2.动物模型的建立

单侧输尿管梗阻模型建立后，会首先发生肾脏血流动力学与肾脏代谢方面的改变，而后相继出现肾小管损伤和上皮细胞的凋亡、坏死，引发肾间质炎性细胞的浸润、成纤维细胞转分化、肌成纤维细胞的增殖，促进了细胞外基质的积聚沉积，导致肾间质纤维化的发生[84]。单侧输尿管梗阻模型具有对肾小球功能影响较小，不引起血压改变与脂质代谢的异常，模型出现肾间质纤维化所需时间相对较短，实验动物单侧输尿管结扎后1周内，结扎侧肾脏即开始出现肾间质纤维化的病理改变，单侧输尿管梗阻模型可参与的相关实验研究方向较多、结果稳定，结扎侧肾脏伴有许多可量化的细胞和分子病理生理变化[85]，且实验动物死亡率较低等优点，是研究肾小管间质纤维化应用最为广泛的实验动物模型[86]。因此，本课题在动物模型制备方法上选择了单侧输尿管梗阻法建立大鼠模型用以研究观察药物对抗慢性肾衰竭的效果与机制。本实验研究期间观察到采用单侧输尿管梗阻法模型复制成功率高，模型制备术后的大鼠肾组织均出现不同程度纤维化的病理改变。7天时梗阻侧大鼠肾组织病理出现改变，14天可出现明显的纤维化，模型制备效果良好，符合文献记录。在手术过程中未有大鼠死亡，术后出现3只死亡大鼠，说明采用单侧输尿管梗阻法，模型制备成功率高，大鼠死亡率低，术后并发症少。

各组大鼠体重变化

结论

本实验仅通过应用大黄附子汤观察Notch信号通路中Notch1、PTEN、Hes1基因转录与蛋白表达的影响，没能对Notch信号通路上下游分子以及信号蛋白间传导分子之间的相关性做研究，未能确定具体的在激活Notch信号通路后发挥作用的传导方式，只是根据结果推断Notch1、PTEN、Hes1的基因转录水平与蛋白表达之间的相关性，并且推断Notch信号通路可能是通过经典的传导方式发挥生物学效应的。本实验设计基于实验结果的实用性与临床应用性的考虑，未选择大黄附子汤与Notch信号通路相关激动剂与抑制剂之间进行对比，若是能够进一步实验，则能更加明确大黄附子汤对Notch信号通路影响的效果以及作用机制。此外，相关的深入研究还需要借助生物化学技术、microRNAs转染技术以及生物信息学、基因芯片与遗传学研究等方法探究肾间质纤维化发生过程各种信号通路蛋白的功能与相互的关系，来明确具体的分子机制，以后在条件适当的情况下可以进一步研究探讨，为相关临床疾病的治疗与研究打下基础。实验中未采用梗阻侧与正常侧对照研究，而是单独设立空白组，主要是排除大鼠在接受手术后以及肾组织损伤过程中免疫以及细胞炎性分子等物质对全身机体带来的影响。模型组与给药组表现出的不良状态则与肾脏出现病理改变影响机体相应的生理功能有关

参考文献（略）