本文是一篇医学论文，由于病理解剖学和细胞病理学的影响，当时的临床医学中特别注意对内脏器官病理变化的研究和诊断，想尽各种方法寻找“病灶”，使诊断方法不断充实，诊断手段和辅助诊断工具不断增多。（以上内容来自百度百科）今天为大家推荐一篇医学论文，供大家参考。
前 言
古老的疾病——疟疾，伴随着人们历史进程，早在公元前，古埃及，古罗马和中国就有对疟疾病症的描述和记载，随着人类的活动不断扩大，到 19 世纪初世界各地均有疟疾病例报道。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum），间日疟原虫（P. vivax），三日疟原虫（P. malariae）和卵形疟原虫（P. ovalee）是感染人类常见的四种疟原虫。2004 年，研究人员在马来西亚，泰国和菲律宾等地发现诺氏疟原虫（P. knowlesi）感染病例，该虫成为第 5 种感染人的疟原虫。目前，疟疾仍然在 91 个国家和地区发生和流行，大约有 212 百万人感染，其中恶性疟原虫感染了约 95%的病例。约 42.9 万人因感染疟疾而死亡，五岁以下儿童占比约 70%，恶性疟原虫引起了 99%的死亡病例。在我国，疟疾仍是一种重要的人兽共患病，分布很广，各省和地区均有疟疾病例发生。尤以海南和云南两省居多，其中海南岛以恶性疟原虫感染病例为主；而云南省间日疟原虫和恶性疟原虫都很流行。由于缺乏有效的疫苗，药物治疗仍是目前疟疾主要的防控手段。尽管人们在药物研发上取得了最大的成果，但是在东南亚，非洲等地，恶性疟原虫对青蒿素、奎宁和氯喹等常用药物的抗药性兴起和扩散，已成为全球防控疟疾的重大威胁。为了探求恶性疟原虫抗药性的机制，各国的科研人员进行的不懈的努力，发现一些重要的抗性位点，例如 pfmdr1，pfcrt 和 kelch 13 等抗性基因位点的发现。但是恶性疟原虫的抗药性的机理是复杂的，且存在着遗传性和非遗传性的机制。不可能通过已发现的几个基因位点阐明所有的问题。本课题就临床恶性疟原虫株潜在抗性和体外筛选恶性疟原虫对双氢青蒿素抗性两个方面进行了探索。
首先本研究利用中缅边境的临床抗性恶性疟原虫虫株，对新型抗疟试剂盒（Malaria Box）进行了筛选。基于 Malaria Box 对各个虫株的抑制效果，我们一方面鉴定 Malaria Box 中抑虫效果良好的新型化合物，另一方面检测到潜在的抗药性存在，研究结果对新型抗疟药物的研发和使用具有指导意义。之后全基因组测序所用恶性疟原虫株，找寻潜在的抗性基因位点，为恶性疟原虫的抗药机制提供了新的线索。实验的另一部分是体外筛选恶性疟原虫对双氢青蒿素抗性机制的研究，本研究经过近三年的双氢青蒿素（DHA）药物实验室筛选，获得了抗性较高的恶性疟原虫克隆虫株。之后在半数致死量（IC50），药物生存实验，环状体和滋养体生存实验，红内期生长周等表型上加以观察，然后通过全基因组分析，寻找抗 DHA 的抗性机制，尽可能发现新的线索，为以后的研究提供参考。
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第一篇 文献综述
第 1 章 疟原虫研究简介
古老的疾病疟疾，伴随了整个人类的历史的进程[1]。公元前 2700 年，中国及古埃及描述了疟疾的相关症状规律性发热和脾肿大，公元前 200 年左右，疟疾已经传播到罗马，12 世纪蔓延至欧洲全境，19 世纪初期，全世界各个地区均有疟疾病例的报告。疟原虫是疟疾的病原体，属于真球虫目，疟原虫科，疟原虫属的单细胞生物。已知有4种疟原虫可感染人类，分别是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum），间日疟原虫（Plasmodium vivax），卵形疟原虫（Plasmodium ovale）和三日疟原虫（Plasmodiummalariae）[2,3]。其中，P.falciparum 是人类疟疾的主要病原体[4]。目前，疟疾仍然在 91 个国家和地区发生和流行，大约有 212 百万人感染，恶性疟原虫感染了约 95%的病例。约 42.9 万人因感染疟疾而死亡，五岁以下儿童占比约 70%。恶性疟原虫引起了 99%的死亡病例[2]。
1 恶性疟原虫的生活史及入侵细胞研究简介
疟原虫的生活史是一个复杂的过程，它需要经过无脊椎动物按蚊和脊椎动物人类两个宿主(图 1.1)。而在人体内又可分为红外期和红内期两个时期。生长周期起始于雌性按蚊叮咬吸血。疟原虫的子孢子（sporozoites）被植于宿主皮下，sporozoites 随后穿过皮肤到达血液循环。经过大约 30 分钟后，sporozoites到达肝细胞，之后入侵肝细胞，生长发育为裂殖子芽孢（merozoites），待肝细胞破裂后，被释放并进入血液循环。之后 merozoites 入侵红细胞，在红细胞内它将经历环状体（rings），滋养体（trophozoites）完整的两个阶段，最终发育为裂殖子（schizonts）。Schizonts 中含有 8-32 个 merozoites，其中一部分 merozoites入侵新的红细胞，进入下一个红内期；另一部分经过 9-12 天发育为雄性和雌性两种配子细胞（gametocytes），一旦宿主被按蚊叮咬吸血，就会进入按蚊体内，在按蚊体内生长发育行有性生殖。下面将就疟原虫生活周期的具体阶段以及入侵肝细胞和红细胞的机制，进行论述。
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1.2 红外期的发育
恶性疟原虫，红外期发育大约需要 6 天。携带有子孢子的雌性按蚊叮咬人的同时，子孢子伴随着唾液进入人体，经过大约 30 分钟后随宿主血液循环进入肝脏细胞，之后摄取其营养并进行裂体增殖，发育成 merozoites。成熟后胀破肝细胞，释放入血液。一旦入侵红细胞，将开始红内期的生长发育。目前，对于子孢子入侵肝细胞机制的研究，已取得了很大的进展。子孢子经过 20 分钟的宿主血液循环进入肝脏，首先需要突破窦状隙的内皮层，其具体的机制尚未完全阐明，主要存在直接穿过内皮细胞和 Kuppfer 细胞转运两种学说。前者基于子孢子强大的运动能力，认为即使内皮屏障孔隙直径（约 0.1 μM）为子孢子的 1/10，子孢子强大的运动能力也可以使其直接穿过屏障，进入肝细胞[9]。后者经过多年的研究，逐渐丰富的证据表明子孢子进入肝脏的方式为 Kuppfer 细胞的转运。Kuppfer 细胞是分布于肝窦状隙具有很强吞噬能力的巨噬细胞。在子孢子入侵肝脏的时候，它首先进入 Kupper 细胞并形成非酸化的纳虫空泡，以此为依托，子孢子对抗了吞噬和溶酶能力使其存活，最终到达了肝细胞[10-12]。
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第 3 章 体外筛选双氢青蒿素抗药性恶性疟原虫虫株及表型分析...........61
1 材料与方法............61
2 结果.............65
3 讨论.............73
4 小结.............75
第 4 章 恶性疟原虫抗双氢青蒿素药物机制的研究.............77
1 材料与方法............77
2 结果.............78
3 讨论.............83
4 小结.............86
第 4 章 恶性疟原虫抗双氢青蒿素药物机制的研究
恶性疟原虫对临床一线用药 ART 类药物的抗药性的兴起和传播，严重威胁着全球疟疾的治疗和防控。恶性疟原虫抗药性机制一直是重要的研究方向，经过科研人员的不谢努力，取得了一些重要的成绩。Benoit Witkowski 研究团队经过三年的体外 ART 筛选，得到的抗药性虫株，转录组学研究发现热休克蛋白和红细胞表面蛋白的表达的升高；调控细胞周期和 DNA 生物合成蛋白表达的降低[142]。继续培养 Benoit Witkowski 研究小组的获得的抗性虫株，两年后Fre′de′ric Ariey 研究团队获得了抗药性更强的虫株，并鉴定基因 kelch 13（PF3D7_1343700）与 ART 敏感性相关，证实基因的突变引起恶性疟原虫清除速率减慢[69]。随后的 GWAS 分析了大量的恶性疟原虫样本，进一步验证了 kelch13 基因在疟原虫抗 ART 药物方面发挥着重要作用[150]。恶性疟原虫的抗药性的机理是复杂的，且存在着遗传性和非遗传性的机制。不可能通过已发现的几个基因位点阐明所有的问题，本研究对恶性疟原虫株Dd2 长期不间断的给予 DHA 的药物压力，经过近三年的培养，得到具有较强的抵抗 DHA 特性的抗药虫株，通过对其基因组学分析研究，寻找更多 P.falciparum 抗 ART 类药物的机理，为后续的研究提供新的线索。
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结 论
1. 分离驯化得到 67 株临床恶性疟原虫虫株，常用药物筛选发现 8 株虫株存在抗药性，之后使用 Malaria Box 中 356 种化合物筛选。结果一方面发现抑制效果较好的 54 种化合物，为潜在的新型抗疟药物。另一方面发现临床抗药性虫株对 36 种化合物存在敏感性降低，显示交叉抗药性。研究结果具有指导新型抗疟药物使用的意义。
2. 全基因组测序分析临床抗药性虫株后，发现 11690 个 SNPs 和 113 个CNVs，假序列进化树显示了虫株间的亲缘关系。生物信息统计分析得到 21 种基因的 SNPs 与 8 种化合物敏感性相关，11 种基因的 CNVs 与 4 种化合物敏感性相关。新的抗性基因位点的发现，预测了临床抗药性的形成机制。#p#分页标题#e#
3. 首次使用连续药物诱导的方法，成功获得 DHA 抗药性虫株。抗药表型上 RSA、TSA、IC50和复燃能力大幅升高，显示了虫株对 DHA 敏感性下降。另外 8 种常用抗疟药物检测抗药性虫株的结果体现了抗药性虫株的协同抗药性。此外还观察抗药性虫株的红内期时间的增加。研究结果进一步确定疟原虫抗DHA 抗药表型，为快速检测抗药性虫株方法的建立提供参考。
4. 全基因组测序 DHA 抗药性虫株，生物信息学分析得到 35 个基因的 36个非同义 SNPs，值得关注的是涉及抗疟药物的靶位的 10 种基因和 DNA 修复功能的 3 个基因，结果为恶性疟原虫抗 DHA 抗药性机制提供了新的靶向位点。同时得到的 26 个 CNVs 中，9 个抗氧化基因的发现证实了 DHA 的重要作用途径，另外泛素连接酶 E3 涉及到多种药物的抗药性。CNV 为揭示 DHA 抗药性机制的演化发展提供了参考。
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参考文献（略）
