本文是一篇医学论文，随着科学的进步和社会的发展特别是医疗实践的发展，最初的中医学理论已无法诠释新的科学事实，因此，医学理论必须不断创新，才能适应社会需要，这就促使中医学进入汉代以后，呈现出全面发展的阶段。（以上内容来自百度百科）今天为大家推荐一篇医学论文，供大家参考。
引 言
鸡的球虫病主要是由艾美耳球虫导致的疾病，它以肠道出血和高死亡率为特征，并会引起严重的经济损失。全世界报道的鸡球虫有 14 种，但公认的主要有九种，其中柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）毒力最强，对养鸡业造成严重危害。每年鸡球虫病可给全世界造成多达 30 亿美元的经济损失，而我国的经济损失达 4亿美元左右。目前鸡球虫病的防治主要依靠化学药物和弱毒疫苗，但近年来，由于药物残留和活疫苗毒力反强等问题的出现使得鸡球虫病的防治面临严峻考验。研究发现阴道毛滴虫、利什曼原虫、贾第虫、隐孢子虫、柔嫩艾美耳球虫虫体内存在双链 RNA 病毒，这些病毒对原虫的影响已经被广泛报道。阴道毛滴虫病毒能识别宿主 TLR3，TLR3 激活 NF-κB 信号通路，介导宿主抗病毒的特异性细胞因子分泌，从而促进了宿主的炎症反应。利什曼原虫病毒的存在会使宿主疾病加重。贾第虫病毒载量过多会抑制虫体生长并影响贾第虫的繁殖能力。隐孢子虫病毒的存在会增加虫体的繁殖能力。据报道，携病毒的 E. tenella 较不携病毒的 E. tenella 对鸡有更严重的感染能力，它可以使雏鸡盲肠水肿更加严重，肠上皮细胞破裂崩解，肠黏膜破损断裂，然而，E. tenella 病毒对球虫生物特性的调节机制还不十分清楚。
E. tenella 病毒基因组全长 6006bp，它可编码一个 RDRP 蛋白。据报道人、动物和植物中的 RDRP 存在互作蛋白。例如蛋白激酶 C 相关酶 2（PRK2）可以结合并激活 cAMP 依赖的蛋白酶 C 超家族里的丝氨酸/苏氨酸酶，后者可使丙型肝炎病毒的 RDRP 发生磷酸化，而 RDRP 对丙型肝炎的复制有一个正向调节作用。细胞中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶可以和流感病毒 RDRP 互作并正向调节流感病毒 RDRP 的活性。热休克蛋白 70 可以和番茄丛矮病毒的 RDRP 互作并提高复制酶的活性。水稻条纹病毒 RDRP 蛋白 N 端氨基酸的 1-296 氨基酸残基和水稻的 HSP20 互作，并改变了 HSP20 在水稻原生质体中的定位。然而，尚未有原虫病毒尤其是柔嫩艾美耳球虫病毒 RDRP 的互作蛋白方面的研究报道。去泛素化酶（DUBs）是一类数量庞大的蛋白酶类家族。它主要通过水解泛素羧基末端的酯键、肽键或异肽键，将泛素分子特异性地从连接有泛素的蛋白质或者前体蛋白水解下来。人体中的去泛素化酶基因可分为两大类：半胱氨酸蛋白酶家族和金属蛋白酶家族。半胱氨酸蛋白酶家族包含一些泛素特异性加工蛋白酶（USPs），泛素羧基末端水解酶（UCHs），Machado-Josephin 结构域蛋白酶（MJDS）和卵巢肿瘤相关蛋白酶（OTU）。金属蛋白酶家族只包含 MPN(+)/JAMM 蛋白酶家族。OTU 家族主要分为 OTUD 和 OTUB 两种类型，他们各自有不同的功能。OTUD3 可以通过和 PTEN 蛋白互作从而对其稳定性进行调节, OTUD3-PTEN 通路在肿瘤的抑制过程中发挥着重要作用。烟草花叶病毒RDRP自身编码一个OTU去泛素化酶，该酶可以和烟草花叶病毒 RDRP 互作并通过去泛素化作用对 RDRP稳定性进行调节。OTUB1 和 OTUB2 可以互作并去泛素化 TRAF3 和 TRAF6，从而负调控病毒诱导的Ⅰ型干扰素信号通路。在人、动物和植物中 OTU 的去泛素化功能研究较为广泛，而在球虫中尚无去泛素化酶功能的报道，研究 OTU 去泛素化酶的功能为进一步了解球虫的细胞及分子生物学机理做基础。
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第 1 章 寄生虫病毒的研究进展
寄生虫是一类营寄生生活的无脊椎低等动物和单细胞原生生物。根据寄生虫相对于身体的位置，分为体内寄生虫和体外寄生虫[1]。体内寄生虫包括原虫和蠕虫，体外寄生虫一般是节肢动物。近年来，人们在贾滴虫、阴道毛滴虫、利什曼原虫、阿米巴原虫、隐孢子虫和艾美耳球虫中都发现了病毒。寄生虫和寄生虫病毒之间的关系及作用不断被研究者们探索。
1 寄生虫病毒生物学特征
寄生虫病毒首次是通过电子显微镜观察到的，他们发现了阿米巴原虫和利什曼原虫病毒样颗粒的存在[2, 3]。后来，当寄生虫中检测到核酸样病毒样分子，病毒感染寄生虫开始被接受[4, 5]。感染阴道毛滴虫的病毒首次在球虫里被发现，这种阴道毛滴虫病毒生物学特征被描绘并且被鉴定为双链 RNA 病毒[6]。就像阴道毛滴虫一样，许多寄生虫都发现了双链 RNA 病毒。贾第虫和利什曼虫病毒相继被发现，他们和阴道毛滴虫病毒均属于全病毒科单分病毒属[7, 8]。它们的基因组都被不含脂肪或碳水化合物的等大颗粒包装。这些病毒基因组具有两个互相重叠的开放阅读框，编码衣壳蛋白和 RNA 依赖的 RNA 聚合酶。这个病毒家族和其他双链 RNA 病毒家族成员在真菌病毒中都有很好的代表性。其他寄生虫病毒如：阿米巴可鞥氏一个单链 RNA 病毒，它属于弹状病毒家族。Mattern 也报道了阿米巴可能包含一个 DNA 病毒。此外，棘阿米巴属也能包含腺病毒，它是双链 DNA病毒[9, 10]。人们关注寄生虫病毒主要是病毒对寄生虫与宿主关系的影响。在寄生虫中的某些病毒可能调节寄生虫和宿主的相互作用并且对寄生虫的感染和致病机制产生影响。某些病毒可能作为一种“武器”，它增加寄生虫在宿主体内的感染性和持久力。也有其他情况下，病毒存在于寄生虫内能减轻寄生虫对宿主造成的危害，从而导致寄生虫毒力变弱。这种能力表明病毒可以作为宿主的“盟友”。另一种可能是，当病毒利用寄生虫作为载体进入宿主时，这种寄生虫可以容纳多种病毒，并充当病毒的储存库使它们在不利的环境中存活。
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2 病毒对于寄生虫毒力的影响
在利什曼原虫、阴道毛滴虫和隐孢子虫中，病毒感染可能加强原虫的毒力。这些情况代表了寄生虫和病毒的共生关系。在某些情况下，一个对寄生虫有毒性影响的病毒表现在使寄生虫毒力的减弱，例如贾第虫[11]。同利什曼原虫一样，感染阴道毛滴虫的双链 RNA 病毒出现在宿主人并且可能对人的疾病有影响。阴道毛滴虫是最常见的非病毒性传播的寄生虫，它在人类泌尿生殖道的粘膜上皮细胞上导致了炎症性疾病，人们发现这种阴道毛滴虫通常携带了一种或几种阴道毛滴虫 dsRNA 病毒属的病毒。结果显示，使用人的上皮细胞培养模型，阴道毛滴虫病毒和 TLR3 也在人的上皮细胞上被检测到[12]。原虫病毒通过病原相关分子模式刺激了 TLR3 的活化，这种作用激活了核因子 B、趋化因子白细胞介素 8、干扰素和抗病毒反应的特异性细胞因子的产生，最终放大了在宿主的炎症反应。这种放大的炎症反应可能与滴虫病引起的人类宿主的生殖并发症相关联。甲硝唑是用于治疗阴道滴虫最常见的药物，使用人类上皮细胞为模型，可以通过从垂死的寄生虫中释放病毒 dsRNA 来放大炎症反应[13]。病毒的存在也会影响这种寄生虫所表达的蛋白质的模式。在病毒感染寄生虫的情况下，毒力因子半胱氨酸酶的数量显著增加。这些结果给阴道毛滴虫病毒的出现和病原毒力的增加提供了便利。另有报告显示阴道毛滴虫病毒的出现导致了表达的免疫蛋白 p270 表达的上调和寄生虫的表面表达，表明携带病毒的寄生虫的毒力会增强[14]。p270 的表达可能让寄生虫逃避宿主抗体反应并增强感染的持久力。一些研究表明病毒的出现增加了寄生虫对甲硝锉的易感性[15]。然而，易感甲硝锉的寄生虫在长期培养之后，病毒丢失并且寄生虫更加抵抗药物，这些分离株展示了病毒的存在，并保持了寄生虫对药物的易感性[16]。
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第 3 章 E. tenella TERT 和 OTU 的互作鉴定.........49
1. 材料与方法 .........49
1.1 材料.....49
1.2 方法.....502 结果...........55
2.1 E. tenella 总 RNA 的提取......55
2.2 pGBK-T7-TRBD 重组质粒的鉴定 ...............56
2.3 阳性克隆鉴定 ............56
2.4 重组原核表达质粒的构建 ....57
2.5 重组蛋白的表达及纯化 ........58
2.6 pull down ........58
3 讨论...........59
4 小结...........60
第 4 章 OTU 对 E. tenella 端粒酶活性的影响.........61
1 材料与方法 ..........61
1.1 试验材料 ........61
1.2 方法.....62
2 结果...........67
3 讨论...........74
4. 小结..........74
第 4 章 OTU 对 E. tenella 端粒酶活性的影响
本实验室已经成功构建了 E. tenella 病毒转染载体。因此，本试验利用 E.tenella 病毒载体介导的锤头状核酶抑制了 OTU 基因的表达，阐述了 OTU 蛋白对E. tenella 端粒酶活性的影响，初步探讨了该基因功能。#p#分页标题#e#
1 材料与方法
anti-GAPDH 抗体为碧云天产品；RNase-freeH2O 购买自宝泰克生物试剂公司；Trizol 购买自天根生物科技公司；细胞电转缓冲液购买自上海康朗生物有限公司；TRAP 端粒酶检测试剂盒购买自 Millipore。以 E. tenella cDNA 为模板、OTU -F/OTU -R 为引物，采用 PCR 扩增目的基因，扩增条件：95℃ 3min；94℃ 30s, 55℃ 30s，72℃ 30s，33 cycles；72℃ 5min；将目的基因和 pEtV-GFP-RFP 载体分别经过 BamH I/Sal I 双酶切后用 T4 连接酶连接构建重组质粒 pEtV-OTU。
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结 论
1. 以 pGBKT7-RDRP 为诱饵，利用 E. tenella cDNA 文库筛选出 RDRP 互作蛋白 OTU。成功构建重组真核表达质粒 pFastBacTM-HTA-His-RDRP 和pFastBacTM-dual-GST-OTU，并通过昆虫细胞杆状系统成功表达及纯化 RDRP和 OTU 蛋白。用 pull-down 和免疫共沉淀证明 E. tenella OTU 蛋白是 E.tenella 病毒 RDRP 蛋白的互作蛋白。
2. 通过体外试验发现 E. tenella OTU 可水解 K48-，K6-连接的二泛素并确定其活性位点，并首次发现 RDRP 可增强 OTU 体外的去泛素化酶活性。
3. 成功构建重组原核表达质粒 pGEX-4T-1-OTU 和 pET-32a-TRBD 以及重组真核表达质粒 pGBK-T7-TERT 和 pGAD-T7-OTU。利用酵母双杂交试验和 pulldown 试验确定 OTU 蛋白与 TRBD 蛋白存在互作关系。
4. 利用 E. tenella 病毒载体介导的锤头状核酶 GFP-Ham-OTU 对球虫体内的OTU 进行切割，结果发现 OTU 蛋白表达水平的降低抑制了 E. tenella 端粒酶活性，表明 OTU 蛋白可能正向调控了端粒酶的活性。本研究为深入研究球虫病毒和球虫之间的调节机制奠定基础。
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参考文献（略）
