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前 言
芥子气（sulfur mustard, SM）是糜烂性毒剂的典型代表。糜烂性毒剂是一类能够直接损伤组织细胞，引起皮肤、黏膜的局部炎症、坏死，并能通过皮肤、眼、呼吸道黏膜吸收导致全身中毒的化学战剂。自第一次世界大战中将芥子气引入战场以来，多次在各种冲突中使用，包括意大利入侵埃塞俄比亚、日本侵华战争、两伊战争及最近的叙利亚内战等，均造成重大伤亡[1]。芥子气难防难治，结构简单，易于合成，容易被恐怖分子掌握和利用，是最有可能被用于恐怖袭击的毒剂之一[2]。进入新世纪以来，我国尤其是以北京、上海等为代表的大型城市面临严峻的安全挑战。国内外敌对势力屡次发动恐怖袭击，而利用化学毒剂进行恐怖活动可以最大限度地完成目标(1995 年东京地铁沙林事件就是一个典型的案例)。禁止化学武器组织（OPCW）证实：伊斯兰国（ISIS）等恐怖组织已掌握芥子气的生产和使用方法，并多次在叙利亚和伊拉克使用，造成大量伤亡。此外，芥子气是日本遗弃在华化学武器中的主要化学战剂之一[3]，对我国人民的健康和环境安全构成重大威胁，例如 2003 年的齐齐哈尔“8.4 事件”中 43 人中毒、1 人死亡，受害者身体健康和心理健康都受到了不同程度的损害。芥子气作为化学战剂施放后，在空气中可形成液滴态、雾态或蒸气态，能够通过呼吸道、消化道、皮肤、眼等吸收并造成包括呼吸系统在内的全身性损伤。自第一次世界大战以来，关于芥子气损伤机制的研究一直在持续进行。芥子气是典型的双功能烃化剂，主要与体内的 DNA、RNA 和蛋白质等生物大分子发生化学烃化作用，进而引起多聚 ADP 核糖聚合酶（PARP）激活、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)耗竭、氧化应激、炎症、蛋白水解酶激活、钙紊乱等[4-6]一系列反应，最终导致细胞坏死或凋亡[7]。芥子气与 DNA 的烃化反应速度快，毒性效应高。烃化方式主要有双烃化和单烃化，双烃化又分为链间交联和链内交联两种方式[8]。一般认为 DNA 的链间交联主要引起细胞毒作用，诱导细胞死亡，单烃化则导致 DNA 遗传信息障碍。PARP 是存在于多数真核细胞中的一个多功能蛋白质翻译后修饰酶，它可通过识别、结合结构损伤的DNA 片段而被激活，是 DNA 损伤的分子感受器[9]。PARP-1 是 PARP 家族中最早被发现的成员，具有调节 DNA 复制、转录和修护的功能。芥子气引起的 DNA 损伤可激活体内 PARP-1，大量消耗其底物 β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD+），继而造成ATP 缺乏，引起细胞死亡[10]。芥子气急性暴露和暴露的远期效应均可造成包括白介素（IL）-1α、IL-1β、IL-6、IL-8 和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等在内的炎症因子增多，引起炎症反应[11]。芥子气作为糜烂性毒剂，损伤作用广泛，中毒机制复杂，并且目前临床上没有特效的抗毒药物。因此，积极探索芥子气中毒机制，开发有效的防治药物，对我军战斗力保持、国家公共安全和我国公民健康都具有重大的战略意义。
肺是芥子气损伤的主要靶器官，急性肺损伤是芥子气致死的主要原因之一[12]。在芥子气暴露的早期阶段，由于吸入量不同，对呼吸系统产生的毒性作用包括咽部疼痛或不适，声音嘶哑甚至失声，打喷嚏，鼻分泌物增多，气短等，严重者可能会出现浓痰，肺泡出血，咯血等症状。在战争中经历芥子气袭击的幸存者，一直在遭受不同程度的包括急性呼吸窘迫综合征和慢性呼吸系统疾病在内的身体健康的威胁，如咽喉炎、支气管炎、支气管肺炎、肺纤维化、哮喘等。这些肺部疾病严重影响幸存者的生活质量，甚至会造成癌症等远期效应的发生。而氧化应激是芥子气肺损伤的起始和关键的环节之一[13,14]，但芥子气肺氧化应激损伤的机制十分复杂，迄今尚不清楚。氧化应激是指体内活性氧（reactive oxygen species, ROS）的生物利用与抗氧化作用系统失衡的表现。活性氧是生物体正常细胞代谢过程中的一类产物，包括氧离子、含氧自由基等。大量的活性氧会耗竭体内的谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等物质，引起过氧化物增多，造成抗氧化防御体系受损，也可引起细胞的凋亡、坏死和炎症等一系列的细胞毒作用。有研究表明，在人呼吸道上皮细胞和人支气管上皮细胞中，芥子气可引起线粒体功能障碍，促进活性氧产生，消耗细胞内的抗氧化物质[15,16]。细胞中存在酶促和非酶促的抗氧化系统，对抗活性氧产生的毒性作用。细胞内抗氧化物的减少是芥子气引起氧化应激损伤的主要因素[17]。芥子气可作用于谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、NADPH-细胞色素 P450 还原酶、硫氧还原蛋白还原酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽 S-转移酶等一系列体内抗氧化酶，降低这些酶的活性，这可能是芥子气肺氧化应激损伤的原因之一[18,19]。谷胱甘肽是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂。有研究表明，芥子气损伤后可显著降低谷胱甘肽含量，内源性谷胱甘肽耗竭会增加 ROS 的细胞毒作用，促进氧化应激的发生，增加芥子气对细胞的毒性作用[20]。芥子气可以激活肺组织中内皮型和诱导型一氧化氮合酶的表达，进而合成大量一氧化氮，并与 ROS 反应生成氧化能力更强的过氧亚硝酸根，进而加剧氧化应激损伤[21,22]。虽然在芥子气肺损伤发病机制中氧化应激具有重要作用，但是在清除氧自由基的药物中，尚未发现对芥子气肺损伤临床治疗效果理想的药物。
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第一章 H2S 对芥子气染毒小鼠肺部损伤的作用及机制研究
一、前言
芥子气作为糜烂性毒剂的典型代表，具有强烈的生物刺激性，可以通过吸入、接触等途径对人体产生极强的化学反应，造成包括眼、皮肤、呼吸道和消化道在内的全身性损伤。肺是芥子气中毒主要靶器官之一，氧化应激是损伤过程中起始和关键的环节。H2S 是继一氧化氮和一氧化碳后的第三种气体信号分子。H2S 的生物合成主要是在 CBS 和 CSE 的催化作用下产生。H2S 参与包括肺间质纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺动脉高压等肺部疾病在内的发病与转归，还可以通过降低氧化应激水平，影响多种原因所致的肺损伤，如缺血再灌注、烟雾吸入、创伤、蛇毒等。但是，H2S 在芥子气致小鼠肺损伤过程中的变化及作用尚未见文献报道。本实验采用皮下注射方式建立芥子气染毒小鼠模型，应用荧光分子探针技术准确检测组织中的 H2S 含量，蛋白印迹法检测 H2S 合成酶的变化，研究芥子气染毒后小鼠肺组织中 H2S 的变化及规律。分别给予染毒小鼠 H2S 供体化合物 NaHS 以及 H2S合成酶 CSE 的抑制剂 PPG，通过检测小鼠肺组织的湿/干重比、肺泡灌洗液中的蛋白浓度、肺组织切片来观察肺损伤情况，并通过检测小鼠肺组织中 H2O2,、MDA、GSH/GSSG 和 SOD 判断氧化应激损伤情况，进而分析 H2S 含量变化对芥子气染毒小鼠肺损伤的影响。通过检测 Keap1-Nrf2 通路的 Nrf2、HO-1 和 NQO1 等相关蛋白表达和 Nrf2 下游 GR、GCLC 和 GCLM 等相关基因表达，初步探讨气体信号分子 H2S发挥作用的机制。
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二、材料和方法
染毒后第 3 天取各组小鼠肺组织。小鼠称重后，腹腔注射 10%（W/V）水合氯醛麻醉。将麻醉后的小鼠仰卧固定在手术台上，暴露腹腔后断脊髓放血，暴露胸腔，观察肺组织基本情况后取完整肺组织，用生理盐水冲洗肺组织沾染的多余血液，用滤纸吸干水分，左肺叶放入 4%多聚甲醛组织固定液中，用于制作组织病理切片；右肺叶用于测定 H2S 含量，或经液氮速冻后，保存于-80℃冰箱中，用于其他蛋白及氧化指标测定。按照 BCA 试剂盒说明测定组织研磨上清液中总蛋白浓度。将蛋白标准品完全溶解后，取 10 μl 稀释至 100 μl，得到浓度为 0.5 mg/ml 的蛋白标准品溶液。BCA 试剂 A 与试剂 B 按照体积比为 50: 1 充分混匀，配制适量 BCA 工作液。将蛋白标准品溶液加到 96 孔板中，用标准品稀释液稀释成 0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml。2 μl 组织匀浆上清液和 18 μl 稀释液加入样品孔中。各孔加入 200 μl BCA 工作液，37℃烘箱孵育 30 分钟。用酶标仪检测 562 nm 波长下各孔吸光度，以蛋白标准品浓度为纵坐标，OD 值为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线和待测样品的 OD 值，计算样品蛋白浓度。每个样本重复三次。
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第二章 H2S 对芥子气染毒 BEAS-2B 细胞和 MRC-5 细胞的保护作用及机制研究.............37
一、前言......... 37
二、材料和方法..........37
三、实验结果..............43
讨 论
本实验主要是研究气体信号分子 H2S 在芥子气肺氧化应激损伤中的调节作用及机制。研究中应用多种方法，分别在动物水平和细胞水平上展开实验，研究结果表明，在芥子气损伤早期阶段，H2S 作为信号分子，发挥了重要作用。在芥子气治疗的研究中，含巯基/硫类化合物一直以来都是关注热点之一。Kevin等人报道用巯基化合物 NAC 预处理内皮细胞，可以抑制芥子气引起的细胞死亡[44]。Amir 等研究发现芥子气损伤后给予 GSH 可以提高细胞活力[45]。他们还发现 GSH 耗竭的细胞同正常细胞相比，对芥子气更为敏感；并且当细胞内 GSH 含量较低时，培养基中添加 GSH 可以保护细胞，减轻芥子气损伤。Wilde 研究发现当半胱氨酸浓度超过 1 mM 时可以起到保护作用[46]。Rodgers 等人也提出，在动物方面用于解毒的硫代硫酸钠和 NAC 可以应用于烷化剂的解毒中[29]。H2S 是一种含巯基化合物，它是体内 L-半胱氨酸的代谢产物，也是硫代硫酸钠的前体[33]。目前大量研究表明，H2S 具有明确的的抗氧化作用[47]，但是在芥子气损伤中，H2S 的相关调节作用机制尚未见文献报道。大量研究表明，很多肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺纤维化、缺氧性肺动脉高压、肺缺血再灌注损伤和急性肺损伤等的发病都和内源性 H2S 含量降低有关[42]。慢性阻塞性肺疾病是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎或肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。研究发现，吸烟者与不吸烟者相比，严重的慢性阻塞性肺疾病患者和健康人相比，血清中的 H2S 均明显降低[48]。在香烟烟雾诱导产生慢性阻塞性肺疾病的大鼠模型中研究发现，给予 H2S 供体化合物 NaHS 可以发挥扩张支气管，降低肺病理组织评分，降低肺组织中 IL-8 和 TNF-α 含量的作用，说明内源性 H2S 在慢性阻塞性肺疾病中具有抗炎和扩张支气管的保护作用[49]。哮喘模型的大鼠血浆中 H2S 含量，肺组织中的 CSE 和 CBS 基因的 mRNA 水平均明显低于正常对照组[50]。肺纤维化大鼠血浆中 H2S 含量，肺组织中的 CSE 的活性均明显低于正常对照组，给予 NaHS 后可降低其肺组织中的 MDA 含量。研究说明在肺纤维化大鼠中，H2S 可以发挥抗氧化的保护作用[51]。目前研究发现 H2S 在多种原因所致的肺损伤中均有发挥保护作用，但是没有相关文献报道 H2S 与芥子气所致的肺损伤的关系。
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结论
实验中，应用 RHP-2 荧光探针检测正常小鼠和芥子气染毒后第 1、2、3、4 天小鼠，结果表明芥子气染毒后第 1 天，肺组织中 H2S 含量开始下降；染毒后第 3 天，肺组织中 H2S 含量与对照组相比差异最为明显（P < 0.01）。进一步研究芥子气染毒后小鼠肺组织中 H2S 含量减少与 H2S 合成酶的关系。结果表明芥子气染毒后第 1-4 天中，H2S 合成酶 CBS 没有明显变化，H2S 合成酶 CSE 与对照组相比有降低，尤其是第 3天有显著性差异（P < 0.01）。上述结果说明，芥子气染毒后，小鼠肺组织中的 CSE酶表达下调，H2S 含量降低。表明 H2S 可能参与了芥子气损伤调节过程。进一步研究发现，芥子气损伤后 H2S 含量降低是由于其合成酶 CSE 表达下调。因此，升高内源性 H2S 含量可能对芥子气损伤有改善作用。研究者在实验中常用的 H2S 供体化合物有 GYY4137[52]、SPRC[53]、ACS14[54]和NaHS[43]等。NaHS 是瞬时的 H2S 供体化合物，可以在短时间内被代谢完全[55,56]。GYY4137 等是 H2S 的缓释供体化合物，可持续不断的释放 H2S。实验过程中，为了避免 H2S 的持续释放对实验带来影响，选用 NaHS 作为 H2S 供体化合物。很多研究者在动物和细胞实验中应用 NaHS 升高内源性 H2S 含量[57,58]。本实验中，给予 NaHS可以升高芥子气染毒小鼠肺组织中 CSE 表达和内源性 H2S 含量；给予 PPG 可以降低芥子气染毒小鼠肺组织中 CSE 表达和内源性 H2S 含量。结果与目前文献报道研究结果相符。Zhang 等人的研究表明在过敏豚鼠的血浆 H2S 含量和鼻粘膜中 CSE 表达下调，NaHS 可通过上调 CSE 表达升高 H2S 含量[58]。Han 等人观察到在烟草烟雾暴露的小鼠肺组织中 CSE 和 CBS 表达下调，H2S 合成能力下降，NaHS 可以起到缓解作用[57]。Park 等人报道，单侧输尿管梗阻使肾组织中的 CSE 和 CBS 表达下调，H2S 含量下降；在单侧输尿管梗阻致肾纤维化小鼠模型中，给予 NaHS 可以升高 H2S 合成酶表达和 H2S 含量[59]。本实验中，应用活细胞成像技术测定 H2S 含量中，选用近红外荧光探针 NIR-HS 进行实验。实验发现，芥子气染毒后细胞荧光强度减弱，H2S 含量降低；NaHS 处理组与芥子气组相比荧光强度增强，H2S 含量升高，表明 NaHS 可以升高芥子气损伤细胞中内源性 H2S 含量。
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参考文献（略）
