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前 言
多发性骨髓瘤( Multiple Myelomas MM )是浆细胞疾病中最常见的恶性肿瘤，其主要特征是恶性浆细胞在骨髓中无节制地增殖、广泛地浸润并分泌大量的单克隆免疫球蛋白，同时抑制了正常浆细胞的增殖和多克隆免疫球蛋白的分泌。常见的临床症状包括：感染、发热、贫血、骨骼疼痛、骨质损害、肾功能不全、高钙血症、高粘滞性综合征等。MM 并不是一种非常少见的疾病，美国的发表率约为 4.5/10 万人口[1]，我国尚没有确切的流行病学资料，但部分报道显示每年的发病约率为 2-3/10 万，占全部恶性肿瘤的 1%，占造血系统肿瘤的 10%~15%[1-3]。患者以中老年人为主，50~65 岁多见，40 岁以下少见，我国的中位发病年龄为 57 岁，且发病率随年龄增长而增长，男女比例约为 2.35：1[2]。骨髓瘤骨病(Myeloma Bone Disease，MBD)是指由多发性骨髓瘤导致的骨骼疼痛、高钙血症、骨质疏松、病理性骨折等一系列的溶骨性改变，是 MM 常见的临床表现。其中骨痛最为常见，发生于 70%以上的首诊病例，且随着疾病的进展而加重；约 2/3 的患者就诊时就已经出现了溶骨性改变，甚至有 40%的患者发生了病理性骨折[4-7]；骨质损害常发生的部位有脊柱、胸肋骨、腰椎、骶髂关节等，而颅骨及四肢长骨相对少见。与没有骨骼破坏的患者相比，MBD 患者的生活质量及预后更差，反映肿瘤负荷及疾病严重程度的指标也明显增高[8]。早期明确 MM 患者是否伴骨质破坏，对于 MBD 的治疗及预后判断都具有重要意义。目前，MBD 的诊断主要是根据患者的影像学表现及临床症状，但组织病理结果显示一些细微的骨骼损伤并不能被影像学检查发现；由于患者个体感受的差异，其临床表现往往不能准确反映 MBD 的严重程度。血清学指标具有简单、快速、敏感的特点，能否寻找一种血清生化指标帮助临床医师诊断 MBD，一直是探讨的热点。
研究发现，MBD 患者的溶骨性病变并非由 MM 细胞直接侵蚀骨质引起，而是由于 MM细胞分泌大量的细胞因子，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）等，这些细胞因子被称为破骨细胞激活因子（Osteoclast-activating factors，OAFs），OAFs可激活骨保护素-细胞核因子kappaB受体活化因子配体-细胞核因子kappaB受体活化因子通路（OPG/RANKL/RANK 系统），OPG/RANKL/RANK 系统是破骨细胞增殖、分化、成熟的主要信号通路[9]；MM 细胞还可以分泌 DKK-1(Dickkopf-1)蛋白，抑制 Wnt 信号通路，导致成骨细胞的活性减低[37]。破骨细胞的活性增强，成骨细胞的活性减弱，打破了骨生成和骨吸收的平衡状态，引起骨质损伤。活化的破骨细胞可以分泌抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acidphosphatase TRACP)、组织蛋白酶 K（cathepsin K)和基质金属蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)[1]。TRACP 存在两种亚型：抗酒石酸酸性磷酸酶 5a 同工酶(TRACP-5a)和抗酒石酸酸性磷酸酶 5b 同工酶(TRACP-5b)，其中 TRACP-5b 主要由 OB细胞分泌，其血清中的水平可直接反映 OB 细胞活性和骨吸收状态[10]。Cathepsin K 和MMP-9 可以降解骨基质中的有机质，而 I 型胶原蛋白是骨有机质的主要成分，其被降解时释放β-骨胶原交联(Beta Crosslaps，β-CTX，也称作 I 型胶原 C 端肽交联)。血清β-CTX 的含量与Ⅰ型胶原蛋白降解的速率存在明显的相关性，即骨吸收增加时 I 型胶原降解加速，血清β-CTX 的含量也随之增加，固β-CTX 也是目前国内外公认的能代表骨吸收速率的生化指标[11]。I 型前胶原氨基端延长肽(Collagen type Ⅰ amino terminal extension of the peptide，PINP)是目前评估成骨细胞活性的重要指标，活化的成骨细胞胞内可以合成 I 型胶原蛋白前胶原，I 型胶原蛋白前胶原由特异性蛋白酶切割为 I 型前胶原氨基端延长肽(PINP)、I 型胶原蛋白和 I 型前胶原羧基端延长肽(PICP)。PINP 与 I 型胶原蛋白比例为 1：1，固PINP 可反映 OB 细胞活性及骨形成速率[12-13]。
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1. 资料与方法
1.1 研究对象
自2015年4月1日至2016年10月30日在河南大学人民医院确诊为多发性骨髓瘤，并自愿加入此项课题的患者。本研究共入组 37 名患者，男 23 人，女 14 人，中位年龄为 56（43-70）岁。根据患者的临床症状及影像学表现，分为骨髓瘤伴骨病组（MBD 组）和不伴骨病组（无 MBD 组）；所有入组患者分别于治疗前、第二个疗程结束后的第 10 天、第四个疗程结束后的第 10 天抽取空腹静脉血，同时根据患者的骨痛缓解情况、影像学表现、骨髓细胞形态学及血清学指标进行疗效评估。同期，从河南大学人民医院体检中心抽取同龄健康人 12 名，作为健康对照组，其中男 6 人，女 6 人，中位年龄为 56（51-68）岁。所有的健康对照组已排除近期发生过骨折及存在自身免疫性疾病、肿瘤、HBV、HIV 等病史，并且在采血前两周内无严重的病毒或细菌感染。所有入组人员在采血前四周内均未应用过糖皮质激素、双磷酸盐及免疫抑制剂，四周内无接种疫苗病史。
1.1.1 入组标准
同时满足以下条件①符合 MM 的诊断标准；②首次确诊为 MM；③年龄≤70 岁；④自愿并同意加入此课题研究。
1.1.2 排除标准
出现以下任意一种情况者，应于排除：①不能接受标准化治疗的患者；②确诊之前接受过糖皮质激素或双磷酸盐治疗的患者；③伴严重的心肺功能不全或Ⅳ级高血压病的患者；④伴有第二肿瘤的患者。
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1.2 实验步骤
所有入组患者分别于治疗前、治疗两个疗程后的第 10 天、治疗四个疗程后的第 10天清晨 6:00-8:00 点间抽取空腹静脉血（技术路线图见图 2-1）。健康对照组每两个月抽取一次空腹静脉血标本，共 3 次。常规消毒采血部位，持一次性采血针抽取 4ml 静脉血于促凝管（红头管）内。轻轻颠倒 2 次后置于试管架上，备用。维生素 D3、TRACP-5b、PINP、β-CTX、BNDF、sRANKL、OPG、MIP1-α和 IL-6 均采用了 ELISA 试剂盒检测，现以 TRACP-5b ELISA 试剂盒的检测步骤为例：①实验开始前，提前 20 分钟从冰箱内取出样本及试剂盒，平衡至室温（25℃）。②配置标准品：将标准配于离心机中 10000Χg 离心 1 分钟，加入标准品&样品稀释液 1.0mL 至冻干标准品中，旋紧管盖，上下颠倒数次，静置 10 分钟，待其充分溶解后（此时标准品的浓度为 20mlU/ml），轻轻混匀，然后在 1.5ml 离心管中进行倍比稀释。③倍比稀释标准品：用记号笔把标准品标为 S7，另取 7 只 1.5ml 离心管，依次标为 S0-S6，分别往每个离心管中（S0-S6）加入 500ul 标准品&样品稀释液。从 S7 中取出500ul 标准品（浓度为 20mlU/ml），加入 S6 中，反复吹打数次，使其充分混匀；再从 S6中取出 500ul 稀释液（浓度为 10mlU/ml），加入 S5 中，反复吹打数次，使其充分混匀；依此类推加至 S1，从 S1 中取出 500ul 稀释液（浓度为 0.312mlU/ml）弃掉，S0 不再进行任何处理，作为空白对照组。最后，S7-S0 的浓度依次为 20mlU/ml、10mlU/ml、5mlU/ml、2.5mlU/ml、1.25mlU/ml、0.625mlU/ml、0.312mlU/ml、0mlU/ml。
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3. 讨论 .........27
3.1 多发性骨髓瘤骨病的发病机制 .........27
3.2 维生素 D3 在骨髓瘤骨病中的作用及意 ...........29
3.3 骨代谢指标在骨髓瘤骨病诊断中的意义及价值 .....30
3.4 TRACP-5b/PINP 对 MBD 的诊断价值 ......31
4. 结论 .........33
3.讨论
3.1 多发性骨髓瘤骨病的发病机制
多发性骨髓瘤引起的骨骼损伤并非由 MM 细胞直接侵蚀骨质引起，而是由于 MM 细胞在骨髓腔内大量增殖并分泌细胞因子[20-21]，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-α）等；MM 细胞还可以刺激成骨细胞（Osteoblast,OB）和骨基质细胞（Bone stromal cells，BMSC）分泌肿瘤坏死因子（TNF）、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)、 RANKL 等，这些细胞因子被称为破骨细胞激活因子（OAFs）。OAFs 可以导致破骨细胞（Osteodast，OC）的活性增强，成骨细胞的活性减弱，打破骨吸收与骨形成的平衡，引起骨骼损伤。研究发现 OPG／RANKL／RANK 信号系统在 OC 细胞的激活、分化和成熟过程中，起着关键性的作用[22-23]。OPG／RANKL／RANK 系统有三个非常重要的细胞因子，骨保护素(OPG)、NK-κB 受体活化因子配体(RANKL)和 NK-κB 受体活化因子(RANK)，均在 MBD 的发病中起着重要作用，且它们都是肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）家族成员[9]。RANKL（Nuclear factor κB receptor activation factor ligands）主要由成 OB 细胞和 BMSC细胞合成分泌，是 RANK 的配体,同时也是 OPG 的配体，有膜结合型和分泌型，分泌型是其发挥生物活性的主要形式。RANKL 主要通过与 OC 前体细胞上的 RANK 结合,诱导 c-Fos等转录因子的表达[9],促进 OC 前体向 OC 分化。敲除 RANKL 基因的小鼠患有严重的骨硬化症，且体内缺乏具有活性的 OC 细胞[24]。RANK（Nuclear factor kappaB factor receptor）是 RANKL 的受体,在前体 OC 细胞表面高度表达。OB 细胞分泌的 RANKL 与 OC 细胞上的 RANK 结合，后者将信号专递给 TNF 受体相关因子 6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)，TRAF6 可以激活 NF-κB 复合物，释放 p50 亚基进入胞核，后者结合作用于 DNA 的顺式调控区域，激活破骨细胞的分化成熟，促进骨质吸收[25-27]。与 RANKL 基因敲出的小鼠类似，RANK 基因敲除的小鼠因缺乏有活性 OC 细胞而丧失骨重吸收能力，出现骨质硬化[28]，说明 RANKL/RANK 介导的信号途径是 OC 细胞活化所必要的。#p#分页标题#e#
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结论
4.1 初诊伴骨骼损害的骨髓瘤患者，血清中维生素 D3 浓度较高，维生素 D3 越高的患者，破骨细胞的活性越强，骨骼损伤也越严重，说明维生素 D3 可能增强了 MBD 患者破骨细胞的活性，引起骨骼损伤；
4.2 治疗有效的 MBD 患者血清中维生素 D3 的含量减低，无效者血清中的维生素 D3无明显变化，血清维生素 D3 的含量可以作为 MBD 疗效评估的指标之一；
4.3 四个疗程后，治疗有效 MBD 患者血清中的 PINP 浓度上升，但仍低于无骨骼损害者，提示成骨细胞的活性恢复缓慢，修复骨骼损伤需要一定的时间；
4.4 血清 TRACP-5b 的浓度与骨骼损害的程度正相关，可以作为评估 MBD 患者严重程度的血清学指标；
4.5 TRACP-5b／PINP 的比值可以作为诊断骨髓瘤骨病的指标之一。
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参考文献（略）
