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引 言
急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是指因冠状动脉供血急剧减少或中断(大多是由于冠脉内血栓形成)，使相应心肌持久而严重的缺血导致心肌坏死，引起的血管阻塞导致缺血、缺氧或冠状动脉功能性改变[1]。导致心肌结构和功能产生变化，最终导致患者心功能不全。严重危害人类健康的疾病，AMI 治疗过程中引起的心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI）是临床常见的病理过程。MIRI是由于冠状动脉再通和恢复心肌灌注后,所引起的心肌功能障碍及心肌细胞结构损伤的一系列复杂的病理生理变化过程。近年来，大量临床研究表明动脉搭桥术、溶栓疗法、 经皮腔内冠脉血管成形术、体外循环心脏外科手术和心肺脑复苏术等能够缓解急性心肌梗死患者疼痛，使闭塞冠状动脉再通，可使不可逆的心肌坏死最小化，可有效使患者心脏能够在较短时间内获得血液灌注并恢复氧供应。从而达到减少早期的死亡率，并且改善其预后和心功能。不过，研究显示，患者心肌恢复血流后，只有 1/3 的心肌梗死患者能够通过再灌注获得再生[2]。而其他患者组织损伤加重，出现心律失常、心肌顿抑、坏死、心肌梗塞面积扩大、内皮细胞及微血管功能障碍等不可逆性损伤，是治疗冠心病的重要并发症。因此，有关 MIRI的保护受到了研究者们的重视。MIRI 机制较为复杂，其中（1）活性氧(reactive oxygen species, ROS)学说：羟自由基(OH)、氢氧根离子(OH-)、超氧根阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)等 ROS 的大量产生导致机体氧自由基平衡破坏，从而导致膜蛋白功能抑制，线粒体脂质过氧化，核酸碱基化及 DNA 断裂和细胞凋亡等[3-5]。（2）钙超载学说：心肌缺血再灌注时，心肌组织的肌纤维膜遭到破坏，Na+和 Ca2+交换平衡被打破，胞浆 Ca2+急速上升，可导致线粒体损伤[6]。（3）活化的中性粒细胞学说：活化的中性粒细胞可产生细胞因子、细胞内粘附分子-1 和 L-选择蛋白等粘附因子，使中性粒细胞向血管内皮细胞粘附并释放颗粒状弹性硬蛋白、溶酶体酶、活性氧和细胞因子等。（4）炎性介质学说：MIRI 可导致机体炎性介质释放异常，如血小板刺激因子、血栓烷和白三稀等。在心肌心肌缺血再灌注的 6 h 内，释放的化学引诱物将中性粒细胞吸引至梗死区。在此后 24h 内中性粒细胞迁徙至心肌组织，导致血管堵塞并释放降解酶和活性氧[7]。虽然对缺血再灌注损伤的发生机制尚未完全阐明，但活性氧自由基和炎症反应所导致心肌线粒体功能的不可逆损伤和心肌细胞死亡得到了研究者的广泛认可，其在缺血再灌注损伤病理过程中发挥了重要的作用[8]。
手术过程中应用的麻醉药物、麻醉方式和器械等，均可导致患者产生氧化应激反应。而继发的氧化损伤、炎症反应和应激反应是手术和麻醉过程中常见的病理反应。在手术和麻醉的过程中，患者常伴有氧自由基生成增多和体内耗氧量升高等病理反应，尽管麻醉在手术的过程中可以一定程度的减少患者疼痛和牵拉，但并不能完全阻断植物神经系统对创伤刺激的反应。所以机体仍处于应激的状态，导致氧自由基生成和炎症反应等[9]。目前临床上所用麻醉药物较多，包括烷基酸类药物、阿片类药物、苯二氮卓类药物和肾上腺素受体激动剂等，而各个药物对患者的应激刺激程度不一。阿片类药物中包括芬太尼、舒芬太尼和瑞芬太尼是常用于临床的。有研究表明，瑞芬太尼的静脉麻醉能很好抑制手术中的应激反应，瑞芬太尼复合丙泊酚麻醉比平衡麻醉应激反应要小得多[10]；舒芬太尼具有血流动力学稳定的特点，预处理能够具有一定的心肌保护作用[11-13]。其可通过 PI3K/Akt 信号通路使 GSK-3β 磷酸化，抑制其失活，最终作用于线粒体钾离子通道，从而减少神经细胞的凋亡，保护心肌细胞[14,15]；丙泊酚为烷基酸类药物适用于门诊小手术[16]，其对呼吸和循环系统有抑制作用，而导致患者出现暂时性呼吸停止、心率减慢、血压下降等；Cressey 等[17]通过研究发现，咪达唑仑作为麻醉类药物可以减少药物对呼吸及循环系统的影响。BruMercier 等[18]在研究中表明小剂量咪达唑仑具有中枢镇静作用，但有研究者认为咪达唑仑虽然具有缓解精神紧张作用，但是当采用硬膜外麻醉穿刺时，其对穿刺所引起的机体应激基本无抑制，并且患者血浆 β-内啡肽水平显著升高[19]。右美托咪定是一种高选择性，特异性的 α2-肾上腺素受体激动剂，其作用于激动突触前膜的 α2受体和脊髓内的 α2受体而产生镇静镇痛作用，前者抑制去甲肾上腺素的释放，抑制交感神经活性从而降低患者的应激反应；后者与脊髓内的 α2受体结合而产生镇静镇痛作用[20]。通过激动中枢以及外周 α2-肾上腺素能受体，抑制血液中肾上腺素和去甲肾上腺素的升高，达到增加迷走神经和抗交感神经活性的作用，能有效降低患者的应激反应[21]。七氟烷具有诱导迅速及苏醒快而完全，血流动力学稳定， 与儿茶酚胺类药合用不增加心律失常发生率的优点而得到了临床的广泛应用[22]。研究表明，七氟烷后处理能激活 PI3K/Akt(PKB)和 ERKl/2 信号通路，抑制凋亡蛋白 caspase9，caspase 3 的活化减少心肌缺血再灌注损伤[23-25]。叶治等[26]通过检测 ROS 及线粒体 ATP 敏感性钾离子通道介导七氟烷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的延迟性保护作用及作用机制，结果显示，应用七氟烷预处理后，神经凋亡指数和脑组织的 TNF-α 及 IL-1β 蛋白水平以及 mRNA表达明显降低。
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第一章 两种不同麻醉方式对心肌缺血再灌注模型猪的影响
目前的临床和实验研究表明，猪的心脏与人的心脏冠状动脉结构非常接近，并且侧枝循环少，心肌梗死模型与人心肌梗死病变有很大相似性，对临床以及实验研究心肌梗死的病理生理和治疗方法都有非常大的意义，是进行人类心肌梗死研究理想的动物模型[29,30]。因此，本研究采用巴马系香猪进行心肌缺血再灌注模型的建立。
1.1 材料
1.1.1 实验动物
实验选取健康雄性巴马系香猪30头，6-8月龄，体重15～20kg。术前将其随机分为全凭静脉麻醉组和静吸复合麻醉组，两组香猪在年龄、体重等方面比较，差异均无统计学意义，具有可比性。实验香猪购自泰州泰和生物科技有限公司，饲养于河南大学基础医学院大动物房，温度控制在25±3℃，湿度控制在30±5%。经过1周适应环境后，行心肌缺血再灌注模型建立手术。在饲养和手术过程中，所有实验香猪均按照实验动物3R观点给予人道主义关怀，且本实验经过河南大学基础医学院实验动物伦理委员会批准。
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1.2 实验方式
1.2.1 巴马系香猪的心肌缺血再灌注模型的建立及分组
麻醉方式：两组实验香猪均于术前禁食12h,禁饮4h。手术当日用特制运输笼具，称重并运至大动物实验手术室。以肌肉注射盐酸氯胺酮注射液5mg/kg，咪达唑仑0.5mg/kg,阿托品0.5mg诱导麻醉。实验香猪安静配合后抬至动物手术床（提前打开手术床的加温设置，使温度控制在38℃-39℃），仰卧位，面罩吸氧，开放耳缘静脉通路建立输液通道（术中输入复方氯化钠注射液10ml/kg/L），监测血压，五导联心电图，脉搏氧饱和度（氧饱和夹夹于耳缘）。之后采用不同的麻醉方式行心肌缺血再灌注模型手术。其中全凭静脉麻醉组采用静脉推注丙泊酚（3mg/kg）、舒芬太尼（1μg/kg）和维库溴铵（0.1mg/kg）诱导麻醉，采用4.5-5.0F气管行气管插管术，连接麻醉机，术中持续泵注0.05-0.2μg/kg/min瑞芬太尼和10ng/kg/min和右美托咪啶（170ng/kg/min负荷量10min泵入，10ng/kg/min持续静脉泵泵入）维持麻醉。而静吸复合麻醉组是在全凭静脉麻醉组的基础之上，使术中全程七氟烷（0.5-1.5MAC）吸入，并通过麻醉呼吸机控制其流量。不过在静吸复合麻醉过程中，静脉药的用量略有降低。 行右侧颈内动脉放置动脉穿刺针，固定连接换能器监测有创血压，右侧颈内静脉放置单腔中心静脉导管，缝合固定后，连接换能器监测中心静脉压。呼吸机参数设置为：潮气量12-15ml/kg、呼吸频率16-18次/分、吸呼比1:2。手术方式：常规剃毛备皮、碘伏消毒、铺巾，选取胸骨正中切口，逐层切开皮肤、皮下组织、肌层，自剑突下剪开胸骨，撑开器撑开胸腔暴露心脏，打开心包，暴露前降支，于冠状动脉前降支近心尖1/3处，第二对角支分出处分离冠状动脉，将钝头针带冠状动脉结扎线牵引3-0慕丝线由冠状动脉下心肌穿过并套上冠状动脉结扎导管，用止血钳收紧冠状动脉结扎导管并固定，观察结扎前后各项生命体征，心电图的变化，阻断冠状动脉前降支60min,松开止血钳，恢复前降支血流，缝合心包，逐层关胸，闭合胸腔前鼓肺排尽胸腔腔内积气，术中充分补液以充分扩容，并根据血气分析补充电解质，术毕常规监护、复苏。手术缝合时全凭静脉麻醉组麻醉药物逐渐减量至缝皮时停药， 静吸复合麻醉组手术缝合时停药。术毕自主呼吸恢复（给予新斯的明，阿托品拮抗）拔除气管导管，将实验香猪放回笼具。再灌注时间为6h，期间关注其活动。术中当血压变化值 ＞20%的基础值时，使用多巴胺或去甲肾上腺素升压，以维持实验香猪的血流动力学平稳;当心率降至 ＜ 50 次/分钟 时，静脉注射阿托品0. 3 ～0. 5 mg 以提高心率。#p#分页标题#e#
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第二章 两种不同麻醉方式对 MIRI 的作用机制 ....... 27
2.1 实验试剂 ........ 27
2.2 实验方法 ........ 28
2.2.1 主要溶剂的配制...... 28
2.2.2 NO 的测定........ 28
2.2.3 过氧化氢酶含量测定...... 29
2.2.4 胞内 Ca2+含量测定.........29
2.2.5 炎症因子的检测...... 29
2.2.6 Western Blot..... 30
2.3 实验结果 ........ 31
2.3.1 心肌组织 NO 含量........... 31
2.3.2 心肌组织过氧化氢酶含量...... 32
2.3.3 心肌细胞胞浆内 Ca2+含量......32
2.3.4 炎症因子检测结果.......... 33
2.3.5 两组实验香猪间 Caspase-3 蛋白表达分析 ........... 35
2.3.6 不同时期 Bax、Bcl-2 蛋白表达比较分析 ...... 36
2.4 讨论........ 36
2.5 小结........ 38
第二章 两种不同麻醉方式对 MIRI 的作用机制
MIRI 机制较为复杂，其中 ROS 学说、钙超载学说、炎性介质学说得到了广泛的的研究。尽管目前，对缺血再灌注损伤的发生机制尚未完全阐明，但活性氧自由基和炎症反应所导致心肌线粒体功能的不可逆损伤和心肌细胞死亡得到了研究者的广泛认可。基于 ROS 学说、钙超载学说、炎性介质学说和细胞凋亡对心肌再灌注的损伤机制及麻醉方式与此损伤的关系进行了初步探讨，以期了解全凭静脉麻醉及静吸复合麻醉对心肌缺血再灌注的损伤作用机制的影响。本实验中采用 NO 检测试剂盒对心肌组织 NO 含量进行分析。样品制备：分别称取正常及两组实验香猪（缺血 1h 再灌 6h）心肌组织 100mg，并剪碎。之后按照 RIPA 裂解液的说明要求加入 1ml 裂解液（每 10mg 组织加入 100μl），并用匀浆器将其均浆（冰上操作），使其充分裂解。紧接着，17000g 离心 5min 获取上清液，备用。严格按照 NO 试剂盒的说明要求检测获取的心肌组织上清液中的 NO 含量：a.用 RIPA 裂解液稀释标准品至 100μM、60μM、40μM、20μM、10μM、5μM、2μM和 1μM，同时设置空白对照。b.相应孔在分别加入标准品和待测样品（50μl/孔），之后每孔依次加入 50μl 的 Griess溶液 I 和 II。c.540nm 处检测其吸光值，并制作标准曲线测定待测样品中的 NO 含量。
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结 论
1. 采用全凭静脉麻醉和静吸复合麻醉，进行开胸结扎冠状动脉左前降支均可有效复制巴马系香猪的 MIRI 模型，具有稳定性、可操作性和可复制性等特点。此外，采用静吸复合麻醉可有效减少 MIRI 的程度。
2. 与全凭静脉麻醉相比，静吸复合麻醉可有效减少细胞自由基的释放，Ca2+内流和血清炎性介质释放，减少心肌细胞的凋亡。
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参考文献（略）
