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1. 前 言
现如今恶性肿瘤已经是一类严重的危害着人类健康以及生存的重大疾病,并且其近几年的发病率逐年上升,是会引起人类死亡的第 2 种重大病因。而在所有恶性肿瘤中，肺癌的发病率以及死亡率均高居于首位【1】，根据 WHO 肺癌的分类，可以将肺癌分为鳞癌、腺癌、小细胞肺癌、大细胞癌及其他类型，其中目前肺腺癌是最为常见的类型，多见于女性和非吸烟者，并且肺腺癌的发病率也有升高的趋势【2】，而且许多患者就诊时就已经属于中晚期了，失去了最佳的手术机会，因此其主要的治疗手段为化学治疗或靶向治疗为主的综合治疗，其主要的治疗目的是为了提高患者的生活质量以及延长患者的无疾病进展生存期和总的生存期。现在最常用的化学治疗后的患者近期疗效的评价主要是根据实体瘤疗效评价的标准 RECIST 1.1 版进行评价，其主要采用的是以 CT、MRI 为主的影像学检查手段，对于小病灶的变化不能进行准确的评价，且易受主观因素的影响，并且对于应用靶向药物的疗效并不能评价，因此这种评价方法有时并不能准确的反应出患者病情变化的真实状况，需要寻找新方法来解决这一问题。若能对肺癌患者进行早诊断，早发现病情变化就能及早干预，尽早进行及时治疗，或许就能使患者更多的获益。由于 PD-1 抑制剂在恶性黑色素瘤中取得了良好的结果，因此如今免疫治疗也已经成为肺癌的一个研究热点话题，晚期肺癌患者的机体免疫功能处于抑制状态，而机体的抗肿瘤免疫主要是细胞免疫，免疫正向调节的有 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞等，而其中具有代表性的免疫抑制细胞就是调节性 T 细胞( Regulatory Tcell , Treg)，它是属于 CD4+ T 淋巴细胞的一种，肿瘤患者的 Treg 细胞比例较正常人会增加，会造成肿瘤细胞逃脱免疫监视继续增殖生长，那么肿瘤细胞分泌的血清肿瘤标志物也会出现异常，在一肺癌血清肿瘤标志物 meta 分析的文献中【3】报道了国内文献统计中，肺腺癌单项敏感标志物为 CEA 和 CA125，其中 CEA 的敏感度为 47.5 %，特异度为 92.34 %；CA125 的敏感度为 57 %，特异度为 80.19 %，因此对于晚期肺腺癌患者我们选择了 2 种有价值的血清肿瘤标志物即 CEA 和 CA125 进行检测，血清肿瘤标志物在一定程度上是可以反应肿瘤负荷大小的。许多研究已表明【4-5】，血清肿瘤标志物的高低是与肺癌的诊断治疗以及预后相关的。如何利用 Treg 这一免疫抑制指标进行晚期肺癌患者治疗疗效的评估，为患者及时更改治疗方案并改变患者生活质量、延长生存期提供参考是免疫方面研究的一个热点，目前研究报道中关于 Treg 细胞在晚期肺癌化疗疗效评估中的意义报道较少，而同时对 Treg 细胞和 CEA、CA125 进行检测是否能够提高晚期肺腺癌患者化疗疗效评估的敏感性的看法仍存在着差异，本研究将同时检测 Treg 细胞和 CEA、CA125 对其在肺腺癌化疗疗效评估中的意义进行进一步探讨。通过观察晚期肺腺癌患者外周血中这 3 种肿瘤标志来评价患者的病情，并判断治疗疗效以及判断患者的这 3 项指标之间是否具有相关性。通过检测外周血中的指标来评价患者病情，对于患者易于接受，并且检测过程简便快捷，更加方便进行定期观察病情变化。
肿瘤的发生发展与肿瘤细胞逃避免疫监视有很大关系,其逃避免疫监视的机制跟肿瘤抗原以及免疫系统这两个因素相关，一个因素是肿瘤可能是通过不表达类抗原、其他抗原肽,进而下调细胞的激活表位；另一个因素可能是某些细胞或者因子使机体的免疫监视能力下降,从而使机体的免疫系统没有办法有效的清除肿瘤抗原。Treg 是目前发现最早、研究最多的一种具有抑制免疫作用的特殊 T 淋巴细胞亚群，Sakaguchi S【6】首次报道其发育及功能的失调与许多的免疫相关性疾病密切相关，其中如自身免疫病、肿瘤、炎症、过敏性疾病以及移植排斥等的病情变化过程高度相关。Treg 细胞在控制自身免疫反应时也会造成机体对肿瘤的免疫耐受 ，除了细胞与细胞之间的直接接触，肿瘤细胞与 Treg 细胞本身也可以分泌一些抑制性的炎症因子如 IL-10 , TGF-β 以及肿瘤细胞分泌的其他免疫抑制因素如腺苷（ADO）和 PGE2【7】，这些炎症因子抑制机体免疫，引起肿瘤的免疫逃避，从而引起肿瘤的增长和机体的免疫耐受。Treg 细胞主要包括 CD4+ CD25+ Treg、Tr1、Th3、CD8+ CD28+Treg 等细胞。而今天我们主要讨论的是 CD4+CD25+ Treg 与晚期肺腺癌的关系，其除表达 CD4 分子和 CD25 分子外，特征性标志是叉头状/翼状螺旋转录因子 3（Forkhead transcription factor p3, Foxp3）,但是Foxp3 表达于 Treg 细胞内，检测时必须要求对 Foxp3 固定、破膜，整个操作过程复杂且不利于后续功能的研究。Zhou J 等研究【8】发现 CD127 可帮助区分 CD4+CD25+ Treg细胞和活化的 T 淋巴细胞，活化的 T 淋巴细胞会高表达 CD127，而真正的 Treg 细胞仅表达较低水平的 CD127，并且 Wei S【9】发现 CD127 传代表达的下调和 Foxp3 的阳性表达高度具有高度一致性， 而且 CD127 是表达于细胞的表面，易于检测，染色时也不会对 Treg 细胞造成伤害，因此可以认为将 CD127- 作为 Treg 细胞鉴定和分选的表型标志，因此我们所检测的外周血中的 Treg 细胞所占 CD4+ T 淋巴细胞的比例主要指的就是 CD4+CD25+CD127- Treg 细胞的比例。
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2. 材料和方法
2.1 一般材料
收集我院肿瘤内科 2015 年 5 月至 2016 年 12 月的 42 例 IIIB-IV 期肺腺癌患者的外周血（肝素钠抗凝），其中最终入选者包括男性 25 例，女性 17 例，年龄分布为 36-72岁，中位年龄为 57 岁；健康对照组为我院体检科提供的健康体检者的外周血 20 例，其中男性 11 例，女性 9 例，年龄分布为 39-70 岁，中位年龄为 56 岁。
2.1.1 入组标准
（1）经皮肺穿 刺活检病理活检、经纤维支气管镜病理活检或者通过痰脱落 细胞检 查确诊肺腺 癌，依据国际抗癌联盟（UICC）肺癌 TNM 分期第七版的临床分期确定为 IIIB-IV 期的晚期肺腺癌患者；（2）无手术适 应症或拒绝手术治疗的初治患者；（3）PS 评 分≤1 分，自愿 接受（培美曲塞 +顺铂 /卡铂）方案化学治疗 4-6 个周期；（4）有完整的 病历资料，包括病史、体格检查、常规血液学检查(包括血常规 、凝 血四项、肝 肾功、电解质、 CD4+CD25+CD127- Treg 细胞以及肿 瘤标志 物 CEA 和 CA125)、 CT 与 MRI 等影像学辅助检查等。
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2.2、检测方法
使用三色荧光标记的流式细胞仪检测 CD4+CD25+CD127- Treg 细胞所占 CD4+T淋巴细胞的比例，其正常参考值范围为（3.42±2.06）%。流式细胞术检测(FCM )是1970 年开始兴起的一种单细胞定量分析技术，不仅结合了荧光标记、单抗和计算机等技术,而且还有特别高的检测速率以及统计准确性,并且可从单一的细胞中测得多个参数,这为临床应用和基础实验提供了有效的检测手段。FCM 不仅能够进行淋巴细胞亚群分析,而且可以把不同的淋巴细胞亚群进行区别,并且可以计算出它们相互之间的比例。我们就是通过使用鼠抗人单克隆抗体 CD4 - FITC 标记 、鼠抗人单克隆抗体 CD25 - APC标记以及鼠抗人单克隆抗体 CD127 - PE 标记来检测外周血中 CD4+CD25+CD127- Treg细胞占 CD4+ T 淋巴细胞的比例。（1）分别于第一次治疗前和最后一次结束后复查时的清晨空腹抽取外周静脉血 3-5ml，置于肝素钠抗凝管中。采集后的血液标本可置于４oＣ冰箱保存，６小时内制备样品。（2）样品制备时共取 5 个试管，各管中分别加入 50ul 血样，设其中一个试管为对照组，做标记为对照组 C，其余 4 个试管分别标记为 CD4+，CD25+，CD4+CD25+，CD4+CD25+CD127-,并分别加入相应的抗体 5 ul。充分混匀之后，在避光条件下孵育大约 20 分钟。
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3. 研究结果......13
3.1 晚期肺腺癌组治疗前和健康对照组之间的比较 ...........13
3.1.1 年龄比较 .........13
3.1.2 性别比较 ......13
3.1.3 CD4+CD25+CD127-Treg 细胞、CEA 和 CA125 敏感性的比较.....13
3.1.4 CD4+CD25+CD127-Treg 细胞、CEA 和 CA125 水平的比较.......13
3.2 治疗前后 CD4+CD25+CD127-Treg 细胞、CEA 和 CA125 水平的比较....17
3.3 治疗前后 CD4+CD25+CD127-Treg 细胞、CEA 和 CA125 水平变化与近期疗效评价之间的关系.........21
3.4 治疗前后的 CD4+CD25+CD127-Treg 细胞比例与 CEA、CA125 水平之间的相关性 23
4. 讨论..........27
5. 结论..........33
4 . 讨 论#p#分页标题#e#
肺腺癌是肺癌最常见的病理类型，多见于女性和非吸烟者，而且大多数人确诊时已属中晚期，已经错过最佳的手术治疗时机。并且肺腺癌的发病率近年来有升高的势头，但晚期肺腺癌的诊疗进展却相对缓慢，现今的治疗方式仍是以化学治疗为主的综合治疗，其中晚期肺腺癌患者一线治疗推荐首先进行 EGFR 基因突变和 ALK 融合基因检测，EGFR 基因突变敏感者可以首选 EGFR - TKIs ,如特罗凯和易瑞沙；ALK 阳性者可以选择应用克唑替尼。基于经济以及肿瘤负荷等原因许多患者仍选择使用传统的化学治疗，常见的两药联合化疗方案有主要有培美曲塞+顺铂/卡铂、多西他赛+顺铂/卡铂、紫杉醇+顺铂/卡铂等等，而其中最常用的化疗方案就是培美曲塞+顺铂/卡铂，培美曲塞的疗效以及毒副作用较少，而且只需要化学治疗第一天应用，因此及时有效的评价治疗的疗效就非常重要，因此我们收集的是晚期肺腺癌患者的外周血进行检测。根据RECIST 1.1 版的评价标准主要就是使用 CT 和 MRI 为主的影像学手段，但是很多时候影像学检查发现病情变化较晚，靶向药物应用后无法使用影像学进行评价近期疗效，而且影像学检查评价疗效变化时具有很大的主观因素，很难准确评价肿瘤病灶变化，所以需要寻找其他方法来评价疗效，以便及时根据患者疾病病情变化进行治疗方案的调整，从而有效的提高肿瘤患者的整体生活质量、增加患者的无疾病进展生存期和总的生存期。血清肿瘤标志物是临床治疗过程中经常使用的一种检测指标，患者易于接受，并且检测过程简便快捷，在国内外许多研究中已表明，血清肿瘤标志物的水平的高低和肺癌的诊断治疗以及预后有很大的关系【4】。如今关于免疫功能的研究一直是一个研究热点，其中主要的抗肿瘤免疫方法是细胞免疫。恶性肿瘤的发生发展跟肿瘤患者的机体免疫功能是一种相互作用的关系，当免疫功能低下时恶性肿瘤将会进展；当肿瘤进行性生长时机体的免疫功能又会受到损害，免疫功能降低，这将会造成一种恶性循环。肿瘤发生发展过程中会产生一些抑制细胞（如 Treg 细胞、MDSC 等）和一些抑制因子（如 TGF-β、IL-10 等），其中 Treg 是目前研究较多的人体内具有强大免疫抑制 功能的 CD4+ T 细胞亚群，其在诱导和维持免疫耐受过程中起着关键作 用【 10】。利用联 合检测免疫指标 Treg 细胞与肿瘤标志物 CEA 和CA125 来观 察健康人与 晚期肺腺癌患者以及肺腺癌患者治疗前后的区别，以及 治疗前 后变化与近 期疗效评估的一致性。
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结 论
1．CD4+CD25+CD127- Treg 细胞、CEA 及 CA125 水平与肺癌的发生、发展均有一定关系，可以作为肺腺癌的临床辅助诊断的指标。
2、对于 IIIB-IV 期非小细胞肺癌患者，CD4+CD25+CD127- Treg 细胞、CEA、CA125可作为化疗疗效评估的重要参考指标，同时也证明了培美曲塞联合铂类对晚期肺腺癌患者应用的有效性。
3、CD4+CD25+CD127- Treg 细胞水平随着机体肿瘤负荷的上升而上升，CD4+CD25+CD127- Treg 细胞和肿瘤标志物 CEA 、CA125 是在疾病变化时三者的变化趋势是一致的。
4、对于 III-IV 期不可手术的非小细胞肺癌患者进行 CD4+CD25+CD127- Treg 细胞、CEA 及 CA125 水平同时观察可以对患者治疗疗效和病情变化进行评价，为临床诊治提供一些证据。
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参考文献（略）
