本文是一篇医学论文，医学论文是科技论文的一个分支学科，是报道自然科学研究和技术开发创新性工作成果的论说文章，是阐述原始研究结果并公开发表的书面报告。（以上内容来自百度百科）今天上海论文网为大家推荐一篇医学论文，供大家参考。
前 言
破骨细胞（osteoclast，OC）是一种多核细胞，在绝经后骨质疏松症、牙周炎及类风湿性关节炎患者的全身及局部骨量流失中占有重要地位[1]。骨骼组织结构的一个重要特征是它一直处于不断变化的状态，在破骨细胞和成骨细胞（osteoblast, OB)的共同作用下，时刻处于骨重建的动态过程之中，其中老化的骨组织被破骨细胞清除的过程被称为骨吸收；成骨细胞促进新的骨组织形成来填充骨吸收所形成陷窝的过程称为骨生成。在人的一生中，骨形成和骨吸收持续不断的存在。在正常生理情况下，骨组织中的骨形成与骨吸收可以相互偶联，保持动态平衡。在某些病理条件下，会出现骨重建失衡，即骨形成减少和/或骨吸收增强，就会导致骨量丢失。在众多造成骨质破坏的因素中，破骨细胞分化与功能增强常常是导致类风湿性关节炎、绝经后骨质疏松症、牙周炎等疾病过程中骨质破坏及骨量流失的关键因素。因此对破骨细胞分化及其发挥骨吸收作用过程中相关调控机理进行深入研究，进而找到精确、有效的治疗靶点来维持骨重建的动态平衡，对于预防和治疗骨质破坏相关疾病极为重要。破骨细胞由骨髓中源于单核或巨噬谱系的破骨细胞前体（osteoclast precursor,OCP）在巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor, M-CSF）和细胞核因子 κ B 受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear factor-κ Bligand, RANKL）相互作用下分化形成。其中 M-CSF 促进脾细胞或骨髓细胞向破骨细胞前体的分化，并促进了破骨细胞前体的存活和增殖。而 RANKL 除了在破骨细胞前体向破骨细胞的分化、存活的过程中发挥重要作用以外，在破骨细胞发挥其骨吸收作用过程中也具有极为重要的地位。核因子 κB 受体活化因子配体是肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor , TNF）家族的一员，与集落刺激因子相互作用介导破骨细胞终末期分化。RANKL 与其受体 RNAK 结合后，可募集如 TNF受体相关因子（TNF reseptor-associated factor , TRAF）蛋白家族等转接分子，从而激活信号转导通路，最终促进破骨细胞形成[2]。TRAF1 , TRAF2 , TRAF3 ,TRAF5 和 TRAF6 均被招募到 RANK 胞内段[3][5]，但是其中仅有 TRAF6 在RANKL 诱导的破骨细胞生成中发挥作用。因为目前的研究证实，在有明显骨硬化症的三组小鼠成长过程中，TRAF6 水平是明显降低的[6][8]。但有趣的是，在TRAF6-/-小鼠组，骨质中的破骨细胞数目是正常的[6]，其他两组中破骨细胞数目极少或没有[7][8]；但是在体外用培养板培养时，在 RANKL 刺激下，三组小鼠的破骨细胞前体均不能分化为破骨细胞[6][8]。然而，一些研究报道破骨细胞生成并不依赖RANKL-RANK-TRAF6信号转导通路。因为在体外实验中，用 TNF+TGFβ（转化生长因子β，Transforming growth factor β）共刺激RANKL-/- , RANK-/- 或TRAF6-/- 的破骨细胞前体，均可促进破骨细胞生成[9]，但单用 TNF 或 TGFβ 则不能诱导破骨细胞生成[9][10]，但是有些研究成果却与之相反，有报道称当缺少RANKL 或 RANK 时，TGFβ1[11]或 TNF[12][15]可独自诱导破骨细胞生成。
TRAF6 招募丝裂原活化蛋白激酶激酶（Mitogen-activated protein kinasekinase, MAPKK）家族[16]中的 TGFβ 活化激酶 1（TGFβ-activated kinase 1,TAK1）至RANK跨膜蛋白胞内段，这一过程是由TAK1相关结合蛋白2（TAK1-associatedbinding protein-2 , TAB2）介导的，其中 TAB2 为 TRAF6 和 TAK1 的桥梁[17]。 在这些复合物中，TRAF6 为 E3 泛素连接酶，TAK1 泛素化可导致 TAK1 介导的MAP 激酶磷酸化，并可阻断 κb 激酶的磷酸化[18]，他们均是破骨细胞生成的重要早期步骤[19][20]。在很多不同类型的细胞中，TRAF6 和 TAK1 均被招募至 TGFβ受体处来介导非经典 TGFβ 信号通路[21][22]。TNF 受体相关因子 3（TNF receptor associated factor 3, TRAF3)在破骨细胞形成过程中作为一种转接蛋白存在，它通过与细胞膜表面的细胞因子受体相互作用将信号传递到细胞内。TRAF3 同 NF-κB 诱导激酶（NF-κB-inducing kinase , NIK）结合并相互作用后，可促进 NIK 的降解，从而对 NF-?B 非经典信号通路产生抑制作用。我们团队之前发表的论文显示，TRAF3 可以对 RANKL 及 TNF 诱导的破骨细胞生成产生抑制作用。 近年来，我们研究团队发现，间充质细胞前体（mesenchymal progenitor cell，MPC)中的 TRAF3 被定向敲除后，成骨细胞的分化和骨形成显著受到抑制。此外 TRAF3 也可通过间接途径，即它可以促进间充质细胞前体产生 RANKL，从而促进破骨细胞的分化与成熟，最终导致骨质疏松症的发生，以上所得结果均与年龄相关。因此，TRAF3 在维持骨形成与骨吸收的相互平衡中发挥重要作用，它在抑制破骨细胞形成的同时，也能够促进成骨细胞的分化。我们团队的研究结果还发现，在蛋白水平，年龄较大的小鼠的骨片中的 TRAF3 明显降低。此外，我们的研究结果还显示，RANKL 可促使破骨细胞前体中 TRAF3 的降解，从而促进破骨细胞的形成。更重要的是，在调控成骨细胞分化的众多细胞因子或激素中，我们团队的研究员发现，TGF?1 可以诱导间充质细胞前体中的 TRAF3 降解，这与我们之前的研究结果相同，即 TGF?1 可以抑制成骨细胞的分化，从而使骨形成遭到抑制。此外我们团队成员还发现，与年龄偏小的老鼠相比，年龄偏长的老鼠的皮质骨中的 TGF?1 含量相对较高。
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1 实验材料
1.1 主要仪器
（1）凝胶成像分析仪： Alpha Inntech company（2）普通高速离心机 Thermo Fisher company（3）紫外分光光度计： Beckman Coulter company（4）流式细胞仪： Bio-Rad company（5）恒温水浴箱： Thermo Forma company（6）RT-PCR 仪： Bio-Rad company（7）PCR 扩增仪： Bio-Rad company（8）SensoQuest LabCycler系列PCR仪 SensoQuest company（9）蛋白凝胶电泳装置： Thermo company（10）恒温干燥箱（电热）： Thermo company（11）恒温振荡摇床： Thermo company（12）普通冰箱： Thermo company（13）超低温冰箱（-80℃）： Thermo company（14）全自动高压灭菌器： Thermo company（15）生物安全柜： Thermo company（16）细胞培养箱： Thermo company（17）多功能全自动酶标仪： MultiskanAscent company（18）倒置显微镜： Nikon company（19）核酸电泳装置： Alpha Inntech company（20）低温离心机： Thermo Fisher company（21）超纯水仪： Milli-Q Plus company（22）制冰机： Scotsman company（23）病理组织轮转式石蜡切片机： Thermo Fishercompany（24）冰冻切片机： Thermo Fisher company（25）液氮罐： Thermo company.
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1.2 主要试剂
（1）RANKL： R&D Systems company（2）TNF： R&D Systems company（3）M-CSF： R&D Systems company（4）TGF-β1： R&D Systems company（5）IL-1（白介素-1）： R&D Systems company（6）IL-1 Ra： R&D Systems company（7）ENBREL： Amgen company（8）TGF-βAb(抗体)： R&D Systems company（9）TRAF6Ab(抗体)： Santa Cruz company（10）TRAF3Ab(抗体)： Santa Cruz company（11）ActinAb(抗体)： Sigma company（12）Chloroquin（e氯喹）： Sigma company（13）mouse TNF ELISA337 Ready-SET-Go! Kit： eBioscience company（14）mouse TGFβ ELISA337 Ready-SET-Go! Kit： eBioscience company（15）Alexa Fluor-488 Phalloidin： Thermo Fisher Scientific company（16）Trizol： Invitrogen company（17）α-MEM： Gibco company（18）D-MEM（溶液）： Gibco company（19）DL,2000： Invitrogen company（20）NH4Cl（液体）： STEMCELL company（21）TEMED（液体）： Gibco company（22）FBS(胎牛血清)： Gibco company（23）30%Acrylamide（丙烯酰胺）： Sigma company（24）APS（过硫酸铵）： Sigma company（25）反转录试剂盒： Promega company（26）Tween-20(吐温-20)： Sigma company（27）GelRed（核酸染料）： Sigma company（28）琼脂糖： Sigma company
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2 实验方法.... 13
2.1 取材............. 13
2.2 牛皮质骨片的制备及处理 ............. 13
2.3 破骨细胞培养....... 13
2.4 肌动蛋白环形成的评价........... 14
2.5 载体构建..... 14
2.6 TRAF3 的过表达 ........... 14
2.7 蛋白质的提取和 BCA 法测定蛋白浓度 ............. 15
2.8 免疫印迹杂交法（Western Blot , WB） .... 16
2.9 酶联免疫吸附剂测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）..... 17
2.10 统计学分析......... 18
3 实验结果.... 19
3.1 RANKL 可增强 TNF 诱导的 TRAF6-/- OCP 向 OC 的分化，促进骨吸收....... 19
3.2 在 TNF 和 TGFβ 的作用下，RANKL 可促进 TRAF6-/-小鼠 OCP 形成 OC和骨吸收陷窝.........20
3.3 TRAF3 抑制 TNF 诱导的来自 TRAF6-/- OCP 的 OC 形成......... 23
3 实验结果
3.1 RANKL 可增强 TNF 诱导的 TRAF6-/- OCP 向 OC 的分化，促进骨吸收#p#分页标题#e#
我们的研究表明，TRAF6-/-小鼠硬化骨部位中有少量 TRAP 阳性单核细胞，但是我们并没有发现多核破骨细胞，这些小鼠均在出生后 2 周内死亡[7]。但是，我们在 TRAF6-/-系小鼠胫骨表面观察到 TRAP 阳性多核破骨细胞，虽然数量比WT 小鼠少了 4 倍（图 3-1A）。我们之前的研究表明，与 RANKL 相似，在体外有 M-CSF 存在下，TNF 可独立诱导 WT 小鼠的脾细胞向破骨细胞的分化[15]。为了明确是否是这些细胞因子导致了少数破骨细胞的生成，我们用 RANKL 或 TNF培养来自 TRAF6-/-小鼠的 OCP 和 WT 同窝小鼠的 OCP。与之前的研究结果一致[6],7.[9]，在塑料平板上，RANKL 不能诱导 TRAF6-/- 小鼠破骨细胞前体向破骨细胞的分化（图 3-1B）。但是我们发现，在不加入 TGFβ1 时，TNF 可以诱导来自于 TRAF6-/- 小鼠 OCP 的破骨细胞形成，其数量与同窝 WT 小鼠脾细胞的数量一样（图 3-1B）。此外，虽然 RANKL 不能诱导来自 TRAF6-/- 小鼠 OCP 的破骨细胞形成，但它能增强 TNF 诱导的破骨细胞生成（图 3-1B）。重要的是，由TNF 单独诱导的 TRAF6-/- 小鼠 OCP 转化而来的破骨细胞在体外形成的骨吸收陷窝，与 WT 小鼠 OCP 形成的骨吸收陷窝相似（图 3-1C）。
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结 论
1. RANKL 可增强 TNF 诱导的 TRAF6-/- OCP 向 OC 的分化，促进骨吸收。
2. 在 TNF 和 TGFβ 的作用下，RANKL 可促进 TRAF6-/- OCP 形成破骨细胞和骨吸收陷窝。
3. TRAF3 抑制 TNF 诱导的来自 TRAF6-/- OCP 的 OC 形成。
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参考文献（略）
