药学论文哪里有？本研究尝试了副产物4-AD的几种控制方法，包括酶抑制剂筛选、硫酸二乙酯诱变、常压室温等离子体诱变和紫外诱变，并对紫外诱变获得的突变株Z43生物催化过程中发酵培养基成分、发酵条件进行了优化。
1 绪论
1.2 生物催化法制备1α-羟基去氢表雄酮研究
1.2.1 1α-羟基去氢表雄酮的结构和应用
1α-羟基去氢表雄酮（1α-hydroxydehydroepiandrosterone，1α-OH DHEA）又名1α，3β-二羟基-5-雄烯-17-酮，是一种具有一定药理作用的甾体化合物。其化学结构中在1α，3β位置上存在2个羟基，而许多维生素D类药物以及其他许多甾体化合物中也含有1α，3β-二羟基，因此1α-羟基去氢表雄酮可作为维生素D类药物的理想起始原料，同时也是其他甾体化合物的关键性中间体[31]。
1α-羟基去氢表雄酮可应用于马沙骨化醇的合成[32, 33]，后者作为第三代新型的活性维生素D3类物质，可用于甲状腺旁腺功能亢进、银屑病、角化症、跖脓疱病。合成步骤总共7步，具体为1α-羟基去氢表雄酮经叔丁基二甲基氯硅烷（TBSCl）的1,3-位羟基保护，进行wittig反应，通过9-硼双环（3,3,1）-壬烷（9-BBN）引入羟基，羟基烃化后三仲丁基硼氢化锂（L-selectride）开环，再用氮溴代丁二酰亚胺（NBS）溴代、γ-三甲基吡啶（γ-collidine）消除，最后使用四丁基氟化铵（TBAF）脱去硅基保护及光照完成。
3 生物催化过程中副产物4-AD形成原因的初步研究
3.3 实验方法
3.3.1 生物催化过程中4-AD的来源
为确定4-AD的来源，取三组装有25 mL发酵培养基的摇瓶，第一组不接种，置于转速为180 r/min、温度为26.5 ℃的摇床中震荡培养120 h；第二组接种子液0.5 mL，置于转速为180 r/min、温度为26.5 ℃的摇床中震荡培养120 h；第三组接种子液0.5 mL置于转速为180 r/min、温度为26.5 ℃的摇床中震荡培养，在培养48h时补入底物溶液（50mg/mL）2.5 mL，继续培养72 h，每隔12 h分别从三组摇瓶中分别取样，HPLC检测。
培养结束后，对三组摇瓶转化液分别离心，进行固液分离，每组取出20 mL上清液，往其中加入2 mL底物液，置于转速为180 r/min、温度为26.5℃的摇床中震荡培养24 h，HPLC检测。
3.3.2 硫酸铵分级沉淀
按照3.2.1中第二组摇瓶培养方法获得上清液500 mL，在冰浴条件下，将上清液置于磁力搅拌器上，转速调至温和，向上清液中逐渐加入硫酸铵至30%饱和度，过程中用10%氨水控制pH值约为7.0，静置3 h后，4 ℃、10000 r/min离心30 min，收集蛋白沉淀，同样操作分别获得硫酸铵饱和度30~60%和60~80%时的蛋白沉淀。
5 1α-羟基去氢表雄酮生物催化条件优化研究
5.2 实验材料
5.2.1 菌种
选择突变株中1α-OH DHEA产量较高的Z43进行生物催化条件的优化。
5.2.2 培养基
斜面培养基（1L）：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂15.0 g，自然pH。
种子及发酵培养基（1L）：葡萄糖10.0 g、玉米浆粉10.0 g、硫酸铵2.0 g、磷酸二氢钾2.0 g，pH6
5 5.2.3 仪器及试剂
5.2.3.1 主要仪器设备
5.3 实验方法
5.3.1 生物催化方法
（1）斜面培养
从甘油管保藏的草酸青霉菌种中，吸取少量均匀涂布到斜面上，在26.5 ℃温度下恒温培养7 d左右，待整个斜面培养基表面长出丰富的灰绿色孢子时，用牛皮纸包好，于4 ℃冰箱保存备用，保存时间为1-2个月。
（2）种子培养
从斜面菌种上挑取指甲盖大小菌苔，接入到装有25 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，在180 r/min的转速、26.5 ℃的温度下摇床振荡培养24 h。
（3）发酵培养及生物催化
按2%（V/V）接种量将种子液转接至装有100 mL发酵培养基的750 mL摇瓶中，置在180 r/min的转速、26.5 ℃的温度下摇床振荡培养48 h；将5 g底物DHEA用100 mL乙醇和1 g吐温80溶解，配成50 mg/mL的溶液，向发酵液中添加10 mL底物液，26.5 ℃，180 r/min继续培养，每隔12 h取样分析。
结论
本研究主要利用草酸青霉A-1006（Penicillium oxalicum A-1006）发酵培养，对底物DHEA的催化过程进行了研究，完成了副产物的分离纯化及结构鉴定，对副产物峰来源进行了初步研究，尝试了副产物4-AD的几种控制方法，包括酶抑制剂筛选、硫酸二乙酯诱变、常压室温等离子体诱变和紫外诱变，并对紫外诱变获得的突变株Z43生物催化过程中发酵培养基成分、发酵条件进行了优化。
本文通过实验研究获得了以下结论：
（1）在催化底物DHEA产生1α-羟基去氢表雄酮的过程中，转化液存在一较大副产物峰，保留时间为10.68 min，在24 h时浓度最高。对转化后发酵液经萃取、硅胶柱层析、结晶、重结晶得到类白色的副产物晶体，经单晶衍射、核磁共振、红外光谱、质谱、熔点确定副产物为雄烯二酮（4-AD）。
（2）4-AD的产生与菌株、添加的底物 DHEA有关联；4-AD不是培养基中的固有成分，其产生与清液是否加底物DHEA诱导无关，是由于菌株在培养基中生长过程中产生并分泌到细胞体外的一分子量大小在60 KD左右的酶蛋白催化作用。
（3）10种酶抑制剂均未对利用酶蛋白将DHEA转化为副产物4-AD的体外转化过程和摇瓶生物催化过程产生明显影响，未筛选到可使副产物峰4-AD显著降低或者消失的酶抑制剂。DES诱变筛选时，0.6%为最佳诱变浓度，此时菌株致死率为78.1%。DES诱变筛选共获得198株突变菌株，未获得副产物峰4-AD显著降低或者消失的菌株。ARTP诱变筛选时，100 s为最佳诱变时间，此时菌株致死率为77.6%。ARTP诱变筛选共分离出235株突变菌株，未获得副产物峰4-AD显著降低或者消失的菌株。
参考文献（略）
