药学论文哪里有？本研究设计了Anti-VCAM1功能化的GM1@Q胶束，以通过靶向衰老脑血管内皮细胞上的VCAM1分子达到增强的透BBB效应以及抗衰老相关的认知退化效应。我们以高表达VCAM1的bEnd.3细胞为研究对象证明了Anti-VCAM1-GM1胶束对脑血管内皮细胞VCAM1分子的靶向性。
1 绪论
1.2 课题主要内容和技术路线
1.2.1 Anti-VCAM1-GM1@Q胶束的制备及表征
① DSPE-PEG-Anti-VCAM1的合成及表征 利用Anti-VCAM1抗体游离赖氨酸的氨基与DSPE-PEG-NHS的活性酯端反应生成酰胺键合成DSPE-PEG-Anti-VCAM1，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 反应的分子量大小来验证DSPE-PEG-Anti-VCAM1的合成。
② Anti-VCAM1-GM1@Q胶束的制备
称取适量槲皮素溶于DMSO中，使其浓度为3 mg/mL，取一定体积的槲皮素溶液 (使GM1与槲皮素摩尔比为7：1) 以及适量DSPE-PEG-Anti-VCAM1溶液(以Anti-VCAM1量计5 μg/mL) 以50 μL/min泵入搅拌中的浓度为30 mg/mL GM1溶液中，将混合溶液置于4℃静置24 h，将溶液移至透析袋中置于2 L的PBS透析24 h。
③ Anti-VCAM1-GM1@Q胶束的表征
通过测定胶束粒径分布、zeta电位、形貌、载药量和包封率等考察Anti-VCAM1-GM1@Q胶束的物理化学性质。
3 Anti-VCAM1-GM1胶束靶向及体外透血脑屏障评价
3.2 胶束对脑血管内皮细胞bEnd.3细胞VCAM1的靶向作用
3.2.1 TNF-诱导bEnd.3细胞表面VCAM1高表达
当bEnd.3细胞生长密度达到2×105个细胞/皿时，加入0或10 ng/mL TNF-处理12 h。分别消化收集细胞，PBS洗涤2次，重悬于100 μL PBS中，加入5 μL PE-VCAM1抗体，室温避光孵育40 min。以 1000 rpm离心5 min，用PBS洗涤两次，并用100 μL PBS 重悬细胞，使其成为单细胞悬液。然后通过流式细胞仪检测细胞表面VCAM1表达量。
3.2.2 bEnd.3细胞对Anti-VCAM1-GM1胶束的摄取
① 负载DiO胶束的制备
取适量分装好的DiO用DMSO稀释 (使其最终工作浓度为5 μM)并以50 μL/min泵入搅拌中的GM1溶液中或混合有DSPE-PEG-Anti-VCAM1的GM1胶束溶液中，4℃静置24 h后转移至透析袋透析过夜。
② 实验分组
1) 对照组：0 ng/mL TNF-诱导bEnd.3细胞与Anti-VCAM1-GM1@DiO胶束孵育；
2) + TNF-组: 10 ng/mL TNF-诱导bEnd.3细胞与Anti-VCAM1-GM1@DiO胶束孵育； 3) 表达屏蔽组：10 ng/mL TNF-诱导bEnd.3细胞与过量游离Anti-VCAM1孵育1 h后，再与Anti-VCAM1-GM1@DiO胶束孵育。
5 Anti-VCAM1-GM1@Q 胶束体外抗衰老效应评价
5.1 材料及仪器
5.1.1 材料
D-gal已被用于体外诱导细胞衰老[67-69]，为了筛选体外成功诱导PC12细胞衰老的浓度以及验证细胞衰老，我们采用了10 mg/mL，20 mg/mL，30 mg/mL三个浓度的D-gal对PC12细胞进行处理，并对其细胞存活率 (如图5.1所示) 和-半乳糖苷酶活性 (如图5.2所示) 进行检测。10 mg/mL D-gal处理后细胞存活率为79.40 ± 5.78%, 20 mg/mL D-gal处理后细胞存活率为69.55 ± 3.50%, 30 mg/mL D-gal处理后细胞存活率为58.89 ± 4.44%，D-gal处理浓度越大对PC12细胞的增殖抑制越强。同时，对PC12细胞衰老相关-半乳糖苷酶的染色 (图5.2) 发现-半乳糖苷酶染色阳性细胞数及染色程度在20 mg/mL时相较于10 mg/mL处理已产生显著变化，说明细胞已被成功诱导成衰老表型，并且使用20 mg/mL D-gal处理细胞不会使细胞增殖受到过分抑制，因此我们在之后的实验中选取了20 mg/mL这一浓度的D-gal 溶液对PC12细胞进行衰老诱导。
5.2 D-半乳糖苷酶（D-gal）诱导细胞衰老及胶束处理
① PC12细胞培养：PC12细胞使用含10%胎牛血清和2%双抗(青霉素+链霉素)的1640PRIM培养基，于含5%CO2的培养箱中，37℃恒温培养。
② 衰老诱导：称取3 g D-gal用1640培养基配成100 mg/mL的母液，用0.22 μm的滤头过滤，并用1640将母液稀释为含10，20或30 mg/mL D-gal的培养基。
待PC12细胞密度长至80%左右时，换成含 0或者不同浓度D-gal不含血清的培养基处理24 h。
③ 胶束处理：D-gal处理后的细胞随后再分别加入不同浓度(0, 120 μg/mL, 240 μg/mL, 360 μg/mL)Anti-VCAM1-GM1胶束（稀释于含10%血清的PRIM 1640培养基中）处理12 h。
7 全文结论及后续工作建议
7.2 后续工作建议
本研究设计了Anti-VCAM1功能化的GM1@Q胶束，以通过靶向衰老脑血管内皮细胞上的VCAM1分子达到增强的透BBB效应以及抗衰老相关的认知退化效应。我们以高表达VCAM1的bEnd.3细胞为研究对象证明了Anti-VCAM1-GM1胶束对脑血管内皮细胞VCAM1分子的靶向性。以诱导衰老的PC12细胞以及自然衰老小鼠为研究对象证明了Anti-VCAM1-GM1@Q胶束的抗衰老效应以及对衰老小鼠认知能力退化的改善作用。虽然我们在本研究中已经做了许多工作，但仍然存在许多待探讨之处。研究的不足之处以及对后续的研究工作的建议如下：
① 在对Anti-VCAM1-GM1@Q胶束对脑血管内皮细胞VCAM1的靶向性研究中，我们实验组的设计为三组，分别是低表达VCAM1的bEnd.3细胞、高表达VCAM1的bEnd.3细胞以及Anti-VCAM1抗体封闭VCAM1后的bEnd.3细胞对Anti-VCAM1-GM1@Q胶束的吸收。在后续研究中，应将VCAM1基因敲除的bEnd.3细胞也加入探讨范围。而且在此研究中我们仅对最后的吸收结果进行表征，而并未对胶束的内吞过程和途径进行表征。我们仅由最后各组细胞对胶束的吸收量而推断VCAM1分子介导胶束内吞的这一说法似乎缺乏完整的证据，若要对该过程进行深入研究应对内吞的过程进行表征。
② 本研究以自然衰老小鼠作为研究对象，但由于个体差异较大并且并不是所有衰老小鼠都会产生一致的病理变化，没有明确的病理变化及治疗靶点这也就加大了研究的难度和研究结果的不一致性。若要提高研究结果的可信度在后续的研究中应大量增加实验对象的样本量，对研究结果进行概率上的统计来说明问题。或者对实验对象进行病理一致性的筛选，但这一目的实现难度很大。在后续研究中若要对Anti-VCAM1-GM1@Q胶束对衰老个体的某一特征性病理进行集中探究应选择相应的模型小鼠作为研究对象，以确保实验的稳定性。
参考文献（略）
