药学论文哪里有？笔者通过受体的确认，形成了新的诱导分化方法，并且对新方法来源的 TM 样细胞进行了形态学，免疫学，转录组学的分析，明确了此细胞与 TM 细胞是类似的。
材料与方法
4 实验方法
4.1 人眼小梁网细胞的分离
正常供体死亡后 6 小时内取得眼球，分离方法如下： 解剖后，在虹膜角膜角区域可见一个棕色环，用 0.5 mm 刮除器将其与眼球部位分离。用 DMEM 培养基冲洗后，在含有 4 mg/mL 胶原酶 A 和 4 mg/mL 人血清白蛋白的 DMEM 中 37°C 消化 2 h。1500 g 离心 5 min，将沉淀培养于含有 20%的 FBS 的199E 培养基、90 μg/mL 猪肝素、20 U/mL 内皮细胞生长添加剂和 1.7 mM L-谷氨酰胺的 TM 细胞培养液中。将细胞接种于 1%明胶包被的 6 孔板上，培养在 37°C、5%的 CO2 的无菌细胞培养箱内。传代 5~8 代的细胞用于后续实验。
4.2 人 iPSCs 的产生
根据先前研究表明[24]，iPSCs 是从 3 个健康人供体尿液中分离的肾尿道上皮细胞重编程而成的，分别命名为 U1、U2 和 U3。重编程过程如下： 将携带 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 转录因子的非整合仙台病毒感染进入肾尿道上皮细胞，在感染后第 9-28 天形成 iPSCs 克隆，并转移用于扩增。重编程获得的iPSCs 接种在涂有 0.2% Matrigel 的 6 孔板上，在含有重组人碱性成纤维细胞生长因子（rh bFGF）和重组人转化生长因子 β（rh TGF-β）的 mTeSR-1 培养基中培养。然后用 5 mg/mL 胶原酶消化分离 iPSC 克隆，并在 mTeSR-1 培养基中扩增。
结果
1 传统方法诱导 iPSCs 向 TM 样细胞分化的机理及阶段确定
如前面所述[19, 21, 22]，人成纤维细胞重编程的人 iPSCs 使用传统方法可以成功地被诱导分化为 TM 样细胞，在这里，我们用同样的方法诱导人肾尿道上皮细胞来源的 iPSCs 分化为 TM 样细胞。未分化的 iPSCs 是由细胞核大、胞质少的细胞组成的克隆。分化 1 个月的 iPSCs 形态发生改变，呈纺锤形，与 HTM 细胞相似，但其体积比 HTM 细胞小得多（表面积：P<0.01；图 1.1A 和图 1.1B）。在接下来的两个月中，分化细胞继续生长（表面积：5684.0±388.6 μm2，长度：221.4±6.7 μm），直到达到与供体 4（表面积：5978.0±372.0 μm2，长度：200.4±9.0 μm）、供体 5（表面积：5194.0±320.7 μm2，长度：158.4±9.6 μm）和供体 6（表面积：5292.0±299.5 μm2，长度：137.6±4.7 μm；图 1.1B）接近的形态。
我们还观察了细胞在分化过程中的生长速率（图 1.2）。从 iPSCs 到诱导分化 1个月（D30），细胞以 18.4 µm/天的增长速度显著增大。在接下来的一个月（D30~D60），细胞生长速率（长度增长速率：11.6 µm/天）比第一阶段（D0~D30）有所降低。因此，我们将 iPSCs 分化定为两个不同的分化阶段，即 iPSCs 向 TM 前体细胞分化（1个月）和向 TM 样细胞分化（2 个月）。我们的免疫组化分析显示层粘连蛋白 α4（LAMA4），组织金属蛋白酶抑制因子 3（TIMP3），水通道蛋白 1（AQP1），肌纤蛋白（MYOC），IV 型胶原（ColIV）等 TM 标志物在 TM 样细胞和人 TM 细胞中都有很强的表达（图 1.1C）。
2 传统方法诱导分化获得的 TM 样细胞的转录特征
我们先前的研究也支持 iPSCs 向 TM 样细胞分化分为两个阶段，该研究表明iPSCs 在诱导分化一个月后表现出非常稳定的转录特征[21]。对于来自传统方法的 TM样细胞的分化机理进行研究，我们认为受体在分化过程中起着重要的作用。在这项研究中，通过 AutoSOME 分析确定了 iPSCs 分化在每个阶段的高表达受体（图 2.1）。剔除差异倍数小于 4，每千碱基平均片段数（FPKM）小于 1 的基因后，将 6300 个基因提交给 AutoSOME（httP://jimcooPerlab.mcdb.ucsb.edu/autosome）。根据表达模式的相似性将基因归入 136 个集群，根据基因表达模式进一步将其分为 5 组（图 2.2）。在每组中，黑线反映了每个基因的置信度，彩色线条表示 log（FPKM+1）值。如图2.2 所示，第 2 组和第 3 组的基因分别在 TM 前体细胞和人 TM 细胞中表达最高。 通过 GO 分析（httP://www.Pantherdb.org/），选择高表达的受体（见表 1）。
通过检索 PUBMED（httPs://www.ncbi.nlm.nih.gov/Pubmed/；表 2）中的文献，研究它们在干细胞分化或 TM 培养中的作用，转化生长因子-β1 受体（TGFBR1）、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶样 N（PTPRN）和促红细胞生成素受体（EPOR）与多类型干细胞分化密切相关。前列腺素受体（PTGER 和 PTGFR）、表皮生长因子受体（MEGF9 和 EDIL3）和转化生长因子受体（TGFBR2 和 TGFBR3）参与了第二阶段的分化，它们在维持小梁网的功能方面发挥了重要作用。
讨论
由于 iPSC 来源的 TM 样细胞已成为一种很有前途的细胞，它可以降低青光眼眼压[8, 23]和减少房水流出，因此开发一种新的分化方法以产生更具临床可行性的 TM样细胞是至关重要的。根据我们的 RNA 测序数据（图 2.1 和图 2.2），许多与干细胞命运相关的信号发生了变化。值得注意的是，与这些信号相关的配体最终将通过与受体的结合的方式发挥作用，受体将受到多种反馈机制的控制，以确保在 iPSCs 分化过程中达到适当的水平。因此，我们选择了与干细胞分化相关的高表达受体（表2）来建立新的诱导分化方法。虽然使用 U1 来源的 iPSCs 获得的 TM 样细胞的 RT-PCR 结果（图 3.2）与以前的 RNA 测序数据相比有一些不同，但使用尿源 iPSCs 来源的 TM 样细胞的新 RNA 测序数据也显示出 HTGFBR1、HEPOR 和 PTPRN 在 TM前体细胞中的表达最强，HTGFBR、MEGF9、PTGFR、EDIL3、PTGER 在 HTM 中的表达最高（图 5.3）。因此，我们建立了与上述受体相关的配体的新诱导方法（图4.1A）。
与传统方法相比（表 4），我们首先改进了 iPSCs 的来源。与我们之前研究中使用的皮肤成纤维细胞相比，肾尿道上皮细胞更容易从尿液中收集，更适合临床应用。此外，iPSCs 是由携带 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 转录因子的仙台病毒通过非整合方式产生的。避免外源基因表达和突变的不良影响，对临床应用尤为重要。
这种新方法的另一个优点是诱导分化时间较短，大大提高了分化效率。在一周内，未分化的 iPSCs 开始呈现纺锤形的 TM 形态（图 4.2A），这是改变细胞命运和形态的最关键时期（图 1.1A）[21]。随后的分化阶段（14 天）主要变化的是细胞的大小，细胞会一直分化直到达到与 HTM 细胞相同的大小（图 4.2B）。与使用传统方法进行两个月的分化相比，新的方法更有效地产生了 TM 样细胞。分化效率提高的原因可能是新方法中重组细胞因子的浓度高于 HTM 细胞分泌的细胞因子浓度。缩短分化周期对于避免长期培养细胞造成的副作用（如细胞衰老和基因突变[2, 29]）尤为关键。
结论
1. 我们通过单细胞测序的方法明确了条件培养基分化方法的机理，选择了在不同阶段的高表达受体。
2. 通过受体的确认，形成了新的诱导分化方法，并且对新方法来源的 TM 样细胞进行了形态学，免疫学，转录组学的分析，明确了此细胞与 TM 细胞是类似的。
3. 我们提出了一种无异源物，无污染的诱导分化的办法，为干细胞在临床上研究奠定了基础。
参考文献（略）
