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智能型白蛋白融合蛋白载药系统的构建、 表达及细胞评价

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  • 用途: 硕士毕业论文 Master Thesis
  • 作者:上海论文网
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  • 论文字数:34525
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  • 日期:2022-06-13
  • 来源:上海论文网

药学论文哪里有?本课题基于融合蛋白 RHMH18 设计了集生物相容性、肿瘤靶向性、MMP-2 酶响应性和 pH 响应性四大功能于一体的药物递送系统,同时实现化疗与免疫治疗的协同作用。

第一章  绪论

1.1    刺激响应型药物载体

近年来,随着对病理组织认识的加深,具有刺激响应性的智能递送平台在解决癌症免疫治疗问题方面显示出巨大的潜力。刺激响应型递送平台以可控的方式,在不同的时间和空间按需释放有效载荷[6, 28-30]。刺激响应型递送平台的物理化学性质例如:溶解性、亲水性和聚集倾向性等,可以随着特定刺激的响应而发生转变。这些刺激既可以是内源性的,如 pH、活性氧(ROS)、酶和氧化还原电位;也可以是外源性的,如光、温度、超声和磁性。同时,纳米技术和生物工程领域的最新发展也为载体的开发提供了新的方法,不仅提高了癌症免疫治疗的安全性,而且显著提高了疗效。癌症免疫治疗刺激响应型递送平台因而取得了长足的发展[31, 32]。

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第三章 RCD 递药系统的构建及表征

3.1  引言

癌症治疗存在疗效有限、毒副作用严重、易诱发耐药等诸多弊端。为了克服这些长期存在的挑战,研究人员开发了各种肿瘤靶向给药系统,以提高治疗效率和降低毒副作用。另一方面,多种治疗策略的结合是提高疗效和克服耐药的重要策略。例如,化疗可与放疗、基因治疗、磁热疗、光热及光动力治疗等不同的治疗方法相结合,达到协同抗肿瘤治疗的效果。因此,设计和构建完全生物相容性和生物可降解的药物递送系统,通过简单可靠的方法巧妙地将治疗功能不同的药物和靶分子结合起来,用于癌症的联合治疗具有重要意义。

为了改善临床表现,减少不良反应,纳米技术作为一种新兴的战略,已被探索用于提供新的诊断或治疗机制,以精准地治疗癌症。利用纳米粒子或通过分子组装形成的纳米粒子携带具有诊断、治疗功能的分子,在细胞乃至分子水平监控疾病的演变,可有效实现精准化治疗。纳米药物递送系统通过物理或化学途径将抗癌药物或功能分子负载于具有纳米结构的材料内部或表面,使药物产生靶向特异性而被准确递送至病灶部位,并协助药物高效发挥抗癌作用。

第四章  细胞行为评价

4.2  实验材料

4.2.1  实验仪器

本章所使用的实验仪器如表 4-1 所示。

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本章通过体外细胞实验来评估 RCD 药物递送系统的体外细胞毒性、生物相容性、细胞摄取效率等。为了验证融合蛋白 RHMH18 的 RGD 标签能够主动靶向肿瘤细胞,并且肿瘤微环境中的 MMP-2 酶能够对 RCD 进行酶切,形成 RGD-HAS-DOX 和 18His-CpG两部分,分别进入肿瘤细胞和巨噬细胞。因而选用 MMP-2 酶和 RGD 受体 ανβ3-整合素均过表达的人肺癌细胞系 A549 作为肿瘤细胞模型,小鼠单核巨噬细胞系 RAW264.7 作为免疫细胞模型。

4.3  实验方法

4.3.1  培养基配制和细胞培养

人肺癌细胞系 A549 培养基的配制方法:在 DMEM 高糖培养基中添加 10%  FBS、1%双抗(终浓度为 100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素),保存于事先灭菌并烘干的带盖密封广口瓶中,置于 4℃冰箱备用[122]。

小鼠单核巨噬细胞系 RAW264.7 培养基的配制方法:在 DMEM 高糖培养基中添加10%  FBS,保存于事先灭菌并烘干的带盖密封广口瓶中,置于 4℃冰箱备用。用于RAW264.7 细胞培养的胎牛血清,需提前在 56℃水浴加热 30 min 灭活[123]。

A549 细胞的传代:将 A549 细胞培养于 NEST T25 培养瓶中,待细胞生长满培养瓶皿底 70~80%时,进行细胞传代。弃培养瓶中的培养基,将 10 mL PBS 分 3 次加入,洗涤皿底。加入 1 mL 胰酶,室温孵育至轻轻吹打可使 A549 细胞吹打下来[124]。加入 5 mL培养基终止胰酶消化,用移液枪将皿底的细胞轻轻吹打下来,1000 g 离心 3 min,弃上清。加入 4 mL 培养基重悬细胞,将细胞悬液平均分至 2 个 T25 培养瓶中,分别再加入3 mL  新鲜 DMEM 高糖完全培养基。放入 37℃,5% CO2培养箱中培养。

RAW264.7 细胞的传代:将 RAW264.7 细胞培养于 NEST  T25 培养瓶中,待细胞生长满培养瓶皿底 70~80%  时,进行细胞传代。弃培养瓶中的培养基,加 6 mL 新鲜 DMEM高糖完全培养基,用刮刀将皿底的细胞轻轻地刮下来,用移液枪将细胞轻轻打匀。将细胞悬液平均分至 3 个 T25 培养瓶中,分别再加入 2 mL 新鲜培养基。放入 37℃,5% CO2培养箱中培养。

主要结论与展望

展望

本课题基于融合蛋白 RHMH18 设计了集生物相容性、肿瘤靶向性、MMP-2 酶响应性和 pH 响应性四大功能于一体的药物递送系统,同时实现化疗与免疫治疗的协同作用。但由于实验时间有限,本课题仅在体外细胞实验层面评价该纳米递送系统的抗肿瘤活性,未能开展动物实验,进一步研究 RHMH18 载体的药物递送能力、体内分布情况、抗肿瘤疗效及体内免疫状态。同时,基于本课题的研究发现,以融合蛋白作为纳米递送的载体具有相当大的前景。融合蛋白的多功能赋予了纳米递送系统更强的针对性,不同的治疗体系可以根据治疗目的的不同,设计出适合的蛋白载体,通过不同的方式进入人体靶部位,以提高对不同肿瘤的特异性诊断和治疗能力。相信在不久的将来,随着研究的深入,将会有更多精巧的基于融合蛋白的递送系统被设计出来,并走向临床。

参考文献(略)

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