药学论文哪里有？文将所开发的 DNA 捕获技术和信号传感技术联用，完成了对非洲猪瘟和新冠病毒的标准序列的检测，证明了一定的技术可行性，打通了从“捕获”到“传感”的 DNA 检测流程，为相关技术开发提供了一定的借鉴。
第一章 绪论
1.2 成簇的规则间隔短回文重复序列（ Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）及其相关核酸酶（Cas）的应用
1.2.1 生物体内 CRISPR/Cas 系统的工作原理
CRISPR/Cas 是一种适应性抗病毒免疫系统，存在于细菌中，通过互相识别发挥作用[13]。这些系统将外来 DNA 片段（称为间隔区）整合到 CRISPR 中，然后转录包含间隔区的 CRISPR 阵列，并对其进行处理以制造用于特异性靶向和切割同源基因组的向导 crRNA（CRISPR RNA）。Cas 蛋白参与 CRISPR 基因转录、目标 DNA 或 RNA 的切割以及新的间隔区整合的不同步骤[14, 15]。具体过程如图 1.4 所示。
第三章 AgIMNPs 对双链 DNA 中 SYBR Green I 共振增强的影响
3.1 前言
目前对于 DNA 检测主要依靠扩增后的荧光传感，通过带有荧光基团的特异性引物探针，在退火延伸过程中结合 DNA 双链并激发荧光。另一种依靠荧光物质与 DNA 嵌合的作用，在扩增结束后结合在 DNA 上通过荧光积累量显示强烈的传感信号。这种信号在早期的初步筛查被广泛的利用，但随之而来的问题同样明显。受限于荧光基团本身的化学和物理性质，在扩增前容易受到光漂白，在退火延伸过程中也容易出现荧光淬灭的现象。因此为了解决上述提出在传感方式上出现的科学问题，提出了通过表面增强拉曼光谱技术对核酸等大分子的新型传感。区别于荧光传感，这种新型的光学传感避免了光漂白和荧光淬灭现象，同时基于高灵敏性和特异性，可以进行核酸的痕量检测。这种新型的传感技术利用贵金属物质例如金、银、铂等纳米粒子，通过电磁效应进行增强。此外利用荧光物质与 DNA 结合后产生的荧光效应可以与电磁效应叠加发生共振增强，在原有的增强效应基础上提高 4~6 个数量级。
因此我们报道了一种通过表面无标记的 SERRS 探针非特异性结合 DNA 双链并检测的新型传感方式，主要利用银纳米粒子表面修饰碘化钾后形成无标记探针，其次将 SYBR Green I 染料和 DNA 分子结合后通过 MgSO4将两个带负电荷的物质结合进行检测。
第四章 AgNPs@dCas9/gRNA 探针对目标序列核酸检测的研究
4.1 前言
基于临床表现，核酸的检测手段主要通过 qP CR。这种具有高灵敏和低样本量的优势目前逐渐取代传统的 PCR 技术成为主要的检测手段之一。随着近两年的发展，同样也出现了以环介导等温扩增 （LAMP） 为主的检测技术。通过四种特异性引物，可以在固定温度下进行扩增。然而，它们都需要多个步骤、操作时间长、引物设计复杂、需要大型仪器，扩增阶段导致的错配问题依然存在。为了克服 qPCR 的局限性，几种核酸传感方法已开发，例如逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）、逆转录环介导的等温扩增 （RT-LAMP）和成簇的规则间隔短回文重复序列 （CRISPR）基于相关核酸酶 （Cas）的核酸检测方法。上述检测方法基本上通过改变温度或通过相应蛋白的参与将 DNA 解螺旋后与含有荧光标记的探针结合并进行检测。近些年，人们将关注点从捕获方式逐渐转移到如何展示“捕获”。对于 CRISPR 的相关核酸酶 （Cas）家族，将 Cas9 合成序列中的 RuvC1 和 HNH 两个区域突变可以得到 dCas9，只保留捕捉能力而失去剪切酶活性，被主要应用到核酸的捕捉工作中。表面增强拉曼技术已经广泛应用于生物传感当中。其高灵敏性、低检测限、高稳定性而被开发成各种生物分子的检测手段。
因此，我们报道了 CRISPR/dCas9 介导的表面增强拉曼散射 （SERS）直接测定 SARS-CoV-2 双链 DNA 的传感方式。设计银纳米颗粒，其表面被 dCas9 蛋白修饰并将其与 gRNA 组合成探针。gRNA 可以特异性结合靶 DNA 序列，最后，富集探针以形成热点。为了诊断 SARS-CoV-2，将 AgNPs@dCas9/gRNA 探针与N 和 Orf1ab 基因反应。在室温下，探针与靶序列结合。随后加入 SYBR Green I并立即进行拉曼检测。SYBR Green I 和 DNA 双链结合，在相同的激发光下，从 Orf1ab 和 N 获得更强 SERS 信号。这种传感方式的优点在于可以直接检测双链 DNA，不局限单链 DNA 或 RNA 的检测。
4.2 实验仪器与试剂
4.2.1 实验仪器
紫外分光光度计（美国 Beckman 公司） 超纯水设备（美国 PORMA 公司） 电泳仪（美国 Bio-Rad 公司） 电子天平（瑞士 METTLER TOLEDO 公司） 凝胶成像仪（中国天能公司） 恒温金属浴（中国蓝焰科技有限公司） 表面增强拉曼光谱仪（美国） 加热旋转仪（中国）
4.2.2 样品和试剂
DNA 电泳 Marker (TIANGEN) SYBR Green I （索莱宝试剂公司） NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）（阿拉丁工业公司） EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺）（阿拉丁工业公司） dCas9 蛋白（实验室自行制备） PBS （阿拉丁工业公司） MgCl2（阿拉丁工业公司） 其他普通化学试剂均为国产分析纯 N 基因质粒（ID：OD987127.1） Orf1ab 基因质粒（ID：MZ151696）
第五章 结论
本论文中在研究 DNA 样本的新型信号传感技术方面，使用具有共振增强作用 SERRS 可以获得稳定的核酸分子信号强度，与传统荧光技术相比，可以有效地避免光漂白和荧光淬灭带来的影响，较普通 SERS 检测提高了几个数量级。在传感元件优化方面，解决了银纳米粒子表面存在大量柠檬酸杂质的常见问题。利用 SERRS 无标记探针预混方式检测 VP72 质粒的最低检测浓度在 0.1 ng/µL，与使用试剂盒检测的最低先测浓度几乎相同。证明了对于应用该传感技术开发双链 DNA 病毒现场检测研究技术的可行性，可以为同类研究提供一定的借鉴意义。
在研究更直接有效的 DNA 捕获技术方面，相对于传统的退火结合方法，CRISPR/dCas9 在 sgRNA 的引导下可以对特定序列的双链 DNA 直接捕获，无需进行解链，不受限于目标 DNA 长度和二级结构对结合过程的影响，更加直接高效，并且这种 DNA 捕获技术可在常温下进行，无需退火结合的变温过程。最终基于 CRISPR/dCas9 介导 SERRS 直接检测 Orf1ab 和 N 基因的最低检测限浓度为 4×105 copies/µL 及 3000 copies/µL。
本文将所开发的 DNA 捕获技术和信号传感技术联用，完成了对非洲猪瘟和新冠病毒的标准序列的检测，证明了一定的技术可行性，打通了从“捕获”到“传感”的 DNA 检测流程，为相关技术开发提供了一定的借鉴。
参考文献（略）
