药学论文哪里有？笔者为了进一步探讨是否可以设计更多新母核结构的靶向 SHP2 突变体的 PROTAC 小分子化合物，合作者设计了 18 个小分子，我们通过酶活实验选出了 5 个有潜力的 SHP2 binder，之后检测分子水平上的 Kd 值发现其中有两个 binder 与 SHP2-WT的结合能力与 SHP099 类似，故这两个化合物有后续设计为靶向 SHP2-WT 的 PROTAC小分子的潜力；但是在 SHP2-E76K 中，目前尚未发现有结合效果突出的 binder。
第一章 绪论
1.1.4 SHP2 抑制剂研究现状
根据靶向区域的不同，SHP2 小分子抑制剂可分为催化位点抑制剂和别构位点抑制剂（或变构抑制剂）。催化位点抑制剂与 PTP 催化口袋特异性相互作用；变构位点抑制剂结合在 PTP 催化口袋之外的区域，对磷酸酶家族的其他成员表现出更高的选择性。与PTP 结构域结合的 SHP2 催化位点抑制剂大多含有可结合到 SHP2 的底物催化口袋的极性基团，靶向磷酸酶的活性位点。通过阻止酪氨酸磷酸化的底物进入催化位点，进而抑制 SHP2 的磷酸酶活性（图 1-4）[26,27]。
然而，传统的 SHP2 小分子抑制剂无论是在特异性还是生物利用度方面都存在局限性 [28]。PTP 结构域催化位点高度保守的序列对于获得具有高选择性的 PTP 结构域靶向抑制剂是一个相当大的挑战。首先在特异性方面，酪氨酸磷酸酶家族中各亚型间催化域的同源性很高，如 PTP 家族成员中的 SHP1、PTP1B 等与 SHP2 的催化结构域高度同源，因此传统的靶向 SHP2 活性位点的抑制剂通常具有较差的选择性。其次，PTP 催化位点的正电荷环境要求 SHP2 催化位点抑制剂具有多个负离子化官能团（如磺酸、羧基、硝基），以实现强相互作用。在药物开发过程中，这些功能基团通常有较差的细胞通透性和口服生物利用度，不适用于临床治疗。
变构位点抑制剂主要与 SHP2 的非催化位点结合，除了选择性较好之外，在生物活性及口服生物利用度方面也都具有明显的优势。它们主要通过与蛋白的闭合构象结合，将酶稳定在非活性的状态，进而对其催化功能产生抑制效果。2016 年，诺华公司通过高通量筛选 10 万个化合物得到 SHP389，之后对其进行结构改造成为 SHP099（图 1-5）。SHP099 作用于 SHP2 的 3 个结构域界面，是首个高活性、高选择性和口服有效的作用于 SHP2 变构位点的抑制剂。SHP099 对 SHP2 有良好的抑制作用（IC50=0.07 μM），而对包括 SHP1、PTP1B 等其他 PTP 蛋白家族都没有明显的抑制活性（IC50>100 μM），尤其对 SHP1 的选择性远优于以前作用于 PTP 结构域的化合物的选择性。结构生物学研究发现，SHP099 通过进入由 C-端 SH2 结构域、N-端 SH2 结构域和 PTP 催化域组成的类似于隧道状的口袋，别构抑制了野生型 SHP2，从而将野生型 SHP2 稳定于自抑制状态。
第三章 SHP2降解剂生物活性及作用机制研究
3.1 实验材料
3.1.1 细胞来源
本章所用细胞为 MV-4-11 细胞，来源同 2.1.1。
3.1.2 试剂耗材来源
3.1 实验材料 3.1.1 细胞来源 本章所用细胞为 MV-4-11 细胞，来源同 2.1.1。 3.1.2 试剂耗材来源
第五章 探寻新母核结构的SHP2降解剂
5.1 实验材料
5.1.1 实验试剂
目前 SHP2 小分子调节剂多以 SHP099 为母核改造而来，包括我们的化合物 11。另外 SHP2 蛋白存在许多突变体，尤其是 SHP2-E76K 最为代表及突出。而我们之前筛选到的化合物 11 虽然对 SHP2-WT 有比较好的降解效果，对突变体却没有理想的作用。故为了拓宽 SHP2 小分子调节剂的母核结构范围，同时设计出更多靶向 SHP2-WT 以及SHP2-E76K 突变体的降解剂。合作者设计了 18 个具有非 SHP099 母核结构的化合物，通过分子酶活测试，筛选出 5 个有潜力的小分子，之后进行与 SHP2-WT 及 SHP2-E76K的结合实验，判断是否可以以此为基础进而设计出更多全新结构的可以降解 SHP2-WT或者 SHP2-E76K 的 PROTAC 小分子。
5.2 实验方法
5.2.1 蛋白质标记方法
基于 MST 方法的蛋白质标记主要分为氨基标记与 His 标记两种。氨基标记法是用于标记和纯化分子质量超过 5 kDa 的蛋白的最优选择。其中，试剂盒中的 RED 染料所携带的 NHS-酯可以与一级氨基（赖氨酸残基）发生共价结合，适用于配置红光检测器（Nano 和 Pico）的 MonolithTM NT.115 系列和 NT.Automated 系列仪器。使用RED-tris-NTA 二代染料标记带有 His-tag 的蛋白或多肽。Monolith 二代 His-Tag 标记试剂盒可用于标记任何带有组氨酸标签的蛋白或多肽，能完成 500 次单点 MST 检测。标记仅需 30 分钟，无需去除过量染料。RED-tris-NTA 二代染料能够特异性结合至少有 6个组氨酸的 His-tags，亲和力高达几 nM。RED-tris-NTA 二代染料的最大激发光与发射光分别为 650 nm 和 670 nm。我们实验室对于 SHP2-WT 与 SHP2-E76K 蛋白最常用的标记方法是氨基标记法。 氨基标记法具体实验操作如下：
1) 缓冲液置换：轻轻倒置试剂盒中的 A 柱三次，使其中液体重新悬浮。拧下底部盖子，并取下上部瓶盖。将 A 柱放置于洁净的 1.5 mL 离心管内，1500 g 离心 1 min 去除柱中的液体，弃掉离心管中的液体并重新将 A 柱放置于离心管中。向 A 柱中心加入 300 µL 标记缓冲液 NHS（操作时小心将缓冲液直接加入到 A 柱中心的树脂膜，切勿使缓冲液沾碰柱子内壁或戳破树脂膜），1500 g 离心 1 min，弃去旋出液。将 A 柱重置于新的洁净的 1.5 mL 离心管中，取 100 µL 预先准备的 10 µM 高纯度蛋白样品置于离心柱中心树脂膜，1500 g 离心 2 min。此时蛋白样品已经收集到离心管中，可弃去使用过的 A柱；
2) 蛋白标记：取一只新的洁净的 1.5 mL 离心管，加入 7 µL 新配制的 RED-NHS 二代染料与 7 µL NHS 标记缓冲液，用移液枪轻轻吸打混合均匀，获得终浓度为 300 µM的染料溶液。另取一只洁净的 1.5 mL 离心管，加入 90 µL 准备好的蛋白样品（浓度 10 µM）。取 10 µL 的上述 300 µM 染料溶液加入到样品中，用移液枪轻轻吸打数次混合均匀，获得 100 µL 染料-蛋白溶液。此时溶液中染料浓度为蛋白浓度的三倍，室温下黑暗处避光孵育 30 min；
主要结论与展望
主要结论
一、本课题合作者利用蛋白靶向降解技术合成了一系列 SHP2 降解剂，之后我们通过系统性生物学评价结合化合物的结构改造发现了对 MV-4-11 细胞株的 SHP2 蛋白具有较好降解效果的化合物 11：
1) 化合物 11 在 MV-4-11 细胞上可以呈时间梯度及浓度梯度地降解 SHP2 蛋白，且在 MV-4-11 细胞上降解 SHP2 蛋白的 DC50为 6.02 nM；
2) 化合物 11 抑制 MV-4-11 细胞增殖的效果要优于阳性化合物 SHP099；
3) 化合物 11 可以引起 MV-4-11 细胞 G1/S 期周期阻滞及细胞凋亡，且化合物 11 的效果要优于 SHP099；
4) 通过 CRBN 调节剂来那度胺与泊马度胺的占位竞争实验及蛋白酶体抑制实验证明化合物 11 降解 MV-4-11 细胞中的 SHP2 依赖 CRBN。之后利用实验室构建好的 CRBN敲除的 MV-4-11 细胞株与未敲除 CRBN 的 MV-4-11 细胞株进行对比，进一步证明化合物 11 发挥 SHP2 降解作用依赖 CRBN；
5) 不足之处在于最后进行细胞水平模拟动物水平药代实验及动物水平上的急性药效试验时，目前暂未看到较好的结果。
参考文献（略）
