药学论文哪里有？本课题主要研究内容及成果如下： 1. 通过使用不同浓度的 SSd 考察 HepaRG 细胞的毒性作用，实验结果表明SSd 在一定的浓度范围内对 HepaRG 细胞没有显著毒性。因此，本研究选用该浓度范围探讨 SSd 对 HepaRG 细胞 CYP3A4、CYP1A2 和 CYP2D6 的 mRNA、蛋白及酶活性的影响。实验结果表明 SSd 对 CYP1A2 和 CYP2D6 的 mR NA 和蛋白表达有上调作用，对 CYP3A4 则表现出抑制作用；
1 材料与方法
1.3 细胞株及培养条件
HepaRG 细胞系购买自上海冠导生物工程有限公司，培养条件：完全培养基（RPMI 1640 培养基，10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，100 ug/mL 链霉素，50 µM 氢化可的松琥珀酸钠）、分化培养基（完全培养基+2%DMSO），于 37 ℃，5%CO2 培养箱中培养。
根据制造商说明书，取 PBS 干粉一袋，倒入洁净 2 L 烧杯中，加入适量的超纯水，玻璃棒不断搅拌（必要时磁力搅拌器搅拌），使其充分溶解后，定容至2 L 后 121 °C 高压 20 min 灭菌，置于超净台紫外灭菌冷却至室温即可使用。 2.1.2 5 mg/mL 噻唑蓝（MTT）溶液 精密称取 250 mg MTT 粉末置于 50 mL 烧杯中，加入 50 mL 的 PBS 溶液充分溶解后，用 0.22 μm 滤过膜过滤除菌，分装后-20 °C 冰箱避光保存。
3 结果
3.1 柴胡皂苷 d 对 HepaRG 细胞的毒性试验
SSd 对 HepaRG 细胞毒性试验主要是为了确定其对细胞无显著毒性的适宜浓度范围，以便后续的药物代谢研究。结果如图 3 所示，与对照组相比，SSd 在0-10 µM 范围内对细胞的活力无显著影响( P > 0.05 )，在 20-40 µM 浓度范围内对细胞有明显的毒性。因此，本实验选择在 0-10 µM 浓度范围内的 SSd 溶液用于后续的药物代谢研究。
3.2 SSd 对 HepaRG 细胞CYP450 酶 mR NA 表达的影响
结果如图 4 所示，与对照组比较，50 µM 的利福平处理细胞后显著上调CYP3A4 的 mRNA 表达 (图 4a )，SSd 在 5 和 10 µM 浓度以剂量依赖方式显著抑制 CYP3A4 的 mRNA 表达，相反诱导了 CYP2D6 的 mRNA 表达（图 4c）；同时在 1、5、10 µM 浓度范围以剂量依赖方式显著上调 CY1A2 的 mRNA 表达水平（图 4b）。
4 讨论
临床实践中，绝大多数药物相互作用都与 CYP450 酶有关[65]，CYP450 参与了 90％以上的临床药物代谢[66]，被 FDA 推荐作为预测药物相互作用的主要指标之一[67]。传统中药具有广泛的药理作用和相对较低的毒性而被开发为药物和膳食补充剂[68]。然而，它们在体内的生物转化、药物-药物相互作用以及传统中药中大量有效成分是 CYP450 酶的代谢底物直接或间接导致的疗效和安全性问题也越来越受到人们的关注[4]。根据 2015 年版《中国药典》收载柴胡是北柴胡或柴胡的干燥根。在临床上，它被中国、日本和韩国等亚洲国家用于治疗发热、肝炎和其他炎症等[69]已有两千多年的历史。迄今为止，已从柴胡中分离并鉴定出43 种柴胡皂苷，其中 SSa、SSc、SSd 含量最高，而 SSd 被认为是具最强的生物学活性[70]，具有抗肿瘤、抗炎及抗氧化等多种药理作用[71]。此外，SSd 相应的脂质体及纳米颗粒制剂已有相应的研究，然而 SSd 对 CYP450 酶的影响鲜有文献报道。因此明确SSd对CYP450的影响以避免潜在的药物相互作用具有重要的意义。本课题采用 HepaRG 细胞测定 SSd 对 CYP3A4、CYP1A2 和 CYP2D6 的 mRNA和蛋白表达及酶活性的影响，以期为 SSd 或柴胡相关临床制剂的药物相互作用提供实验依据。
本研究采用利福平为阳性对照，与空白对照组比较，利福平显著诱导了HepaRG 细胞中 CYP3A4 的 mRNA 和蛋白表达如图 4 和 5，它的相对酶活性也被相应的诱导如图 6。利福平是一种广谱、经典、非特异性的肝酶诱导剂，能够诱导 CYP3A、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6，但是利福平对 CYP3A 的影响最大[72]。FDA 推荐利福平可以作为 CYP3A4 的强诱导剂以评估相关的药物相互作用研究[73]，本研究的实验结果也与之一致。此外，本研究的研究结果发现 5 和 10 µM 的 SSd 能以浓度依赖方式显著抑制 HepaRG 细胞CYP3A4 的 mRNA 和蛋白的表达如图 4 和 5，探针药物法实验也证实 CYP3A4酶的相对酶活性也被相应的抑制。研究报道 CYP3A4 在肝脏中占到了 CYP450酶总重量的 60%，介导了包括环孢素、他汀类药物和大环内酯类抗生素等约 50%的临床治疗药物的代谢[74]。此外，绝大多数中药也能影响 CYP3A4 的酶活性，从而改变经 CYP3A4 代谢药物的血药浓度。例如贯叶连翘可通过诱导 CYP3A4酶活性而降低环孢素的血药浓度[75]。文献报道在服用 CsA 的肾移植患者同时服用小柴胡冲剂后导致前者的血药浓度增加[9]。本研究的实验结果表明 SSd 能够以剂量依赖方式抑制 CYP3A4 的基因、蛋白表达及酶活性。SSd 作为柴胡中主要的生物学活性成分以及含量最高，而 CsA 在肝脏中主要由 CYP3A4 酶代谢，因此这可能是小柴胡冲剂与 CsA 同时服用导致 CsA 浓度增加的原因之一。
5 结论
本课题基于课题组前期对小柴胡汤的研究及以往将 RADA16-I 自组装短肽作为药物载体和细胞培养支架研究的基础上，选择 HepaRG 细胞作为体外药物代谢研究模型，建立离子互补型自组装短肽 RADA16-I 水凝胶 HepaRG 细胞 3D 培养，探讨柴胡皂苷 d 对 2D 及 3D 培养的 HepaRG 细胞中药物代谢酶 CYP1A2 的基因、蛋白及酶活性影响的差异，以分析 HepaRG 细胞自组装短肽三维培养体系作为体外药物代谢及相互作用研究模型的可行性。主要研究内容及成果如下：
1. 通过使用不同浓度的 SSd 考察 HepaRG 细胞的毒性作用，实验结果表明SSd 在一定的浓度范围内对 HepaRG 细胞没有显著毒性。因此，本研究选用该浓度范围探讨 SSd 对 HepaRG 细胞 CYP3A4、CYP1A2 和 CYP2D6 的 mRNA、蛋白及酶活性的影响。实验结果表明 SSd 对 CYP1A2 和 CYP2D6 的 mR NA 和蛋白表达有上调作用，对 CYP3A4 则表现出抑制作用；此外，SSd 对 CYP3A4、CYP1A2和 CYP2D6 的酶活性则与 mRNA 及蛋白表达有一致的趋势，即诱导 CYP1A2 和CYP2D6 的酶活性，对 CYP3A4 则表现出抑制效果。因此，当在临床实践中将经CYP3A4、CYP1A2 和 CYP2D6 代谢的药物与含有 SSd 或柴胡的制剂同时给药时，应仔细观察这些药物的血药浓度改变，以避免潜在的药物相互作用。此外，分子对接研究结果表明 SSd 分子与 CYP3A4、CYP1A2 及 CYP2D6 蛋白的氨基酸残基以氢键及疏水相互作用结合。这些研究结果将会为 SSd 的临床制剂开发和个体化用药提供有益的实验依据和理论参考。
2. 选用自组装短肽 RADA16-I 水凝胶建立 HepaRG 细胞的 3D 培养体系，通过扫描电镜及倒置显微镜观察 RADA16-I 水凝胶的形成情况及支架中细胞的存活情况。同时，钙黄绿素 AM/PI 染色评价细胞活力；RT-qPCR、WB 及探针药物法评价自组装短肽 RADA16-I 水凝胶用于 HepaRG 细胞 3D 培养在药物代谢及相互作用研究中的可行性。结果表明在倒置显微镜下自组装短肽 RADA16-I 形成无色透明的半固体凝胶；扫描电镜下可观察到 RADA16-I 短肽完成自组装后的水凝胶形成的三维网状结构，HepaRG 细胞粘附在三维网状结构中生长；钙黄绿素AM/PI 染色揭示 HepaRG 细胞在水凝胶中存活良好。
参考文献（略）
