药学论文哪里有？笔者认为化合物 11 在分子与细胞水平上对 SHP2 蛋白均有较好的活性与降解效率，但是目前尚未在动物水平上发现较好的效果。究其原因很有可能是大多数降解剂共有的不足之处：即在动物水平上 PK 较差。因此后续我们将继续与化学家合作进行结构优化改造，希望可以发现更多活性更好、具有成药潜力的靶向降解 SHP2 的候选化合物。
第一章 绪论
1.1 SHP2与肿瘤
1.1.1 蛋白酪氨酸磷酸酶
蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）与蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）共同调节蛋白酪氨酸磷酸化。这是一种动态且可逆的翻译后修饰，涉及细胞增殖、分化、迁移等活动 [1] 。酪氨酸磷酸化活性的增加是许多癌症的标志，通常是由于受体 PTK（如 EGFR）和非受体 PTK（如 Abl 和 Src）的过度激活和表达引起的[2]。
PTP 大体分为受体样形式和非受体形式[3]：受体样 PTP 有一个单一的跨膜结构域和可变的胞外结构域；非受体 PTP 结构具有多样性，通常包含靶向到特定亚细胞位置或使其与特定蛋白质结合的序列[4]。PTP 构成了一个庞大的、结构多样的酶家族，参与调控细胞的生命活动。由于这些酶在信号转导中的重要作用，它们的异常调节常常与各种人类疾病的发病机制相关，包括糖尿病、癌症和自身免疫疾病[5,6]。PTP 主要对磷酸酪氨酸（pTyr）残基进行去磷酸化，通常被认为是信号通路的负调控因子和肿瘤抑制基因的产物[7,8]。但是尽管许多 PTP 具有抑制肿瘤的作用，在对人类癌症的遗传信息进行分析发现，一些 PTP 具有致癌活性[9]。可能原因是部分 PTP 除了对受体酪氨酸激酶（RTK）信号转导有负调控作用外，还对 RTK 信号转导有正调控作用[10]。
1.1.2 SHP2 结构与功能
胞内蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP2（SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2)是非受体型酪氨酸磷酸酶。SHP2 全长 593 个氨基酸，结构上，SHP2 具有四个结构域。包括 N 端的两个特有的 SH2 结构域（N-SH2 和 C-SH2）和位于中间的酪氨酸磷酸酶家族所共有的 PTP 催化域及 C 末端具有重要磷酸化修饰位点的尾部结构域 (图 1-1A)。如图 1-1B 所示，在没有上游信号刺激的情况下，N 端的 N-SH2 会以类似底物的形式深入到 PTP 催化域的催化口袋中，并通过盐桥、氢键等作用力使其维持在自抑制状态，C-SH2结构域在这里只起到连接 N-SH2 和 PTP 催化域的作用。当细胞因子刺激时，自抑制结构解除，PTP 催化结构域的活性位点暴露出来，从而对下游信号分子进行去磷酸化，激活参与细胞增殖、迁移和其它相关的下游信号通路。
第三章 SHP2降解剂生物活性及作用机制研究
3.1 实验材料
3.1.1 细胞来源
本章所用细胞为 MV-4-11 细胞，来源同 2.1.1。
3.1.2 试剂耗材来源
第五章 探寻新母核结构的SHP2降解剂
5.1 实验材料
5.1.1 实验试剂
目前 SHP2 小分子调节剂多以 SHP099 为母核改造而来，包括我们的化合物 11。另外 SHP2 蛋白存在许多突变体，尤其是 SHP2-E76K 最为代表及突出。而我们之前筛选到的化合物 11 虽然对 SHP2-WT 有比较好的降解效果，对突变体却没有理想的作用。故为了拓宽 SHP2 小分子调节剂的母核结构范围，同时设计出更多靶向 SHP2-WT 以及SHP2-E76K 突变体的降解剂。合作者设计了 18 个具有非 SHP099 母核结构的化合物，通过分子酶活测试，筛选出 5 个有潜力的小分子，之后进行与 SHP2-WT 及 SHP2-E76K的结合实验，判断是否可以以此为基础进而设计出更多全新结构的可以降解 SHP2-WT或者 SHP2-E76K 的 PROTAC 小分子。
5.2 实验方法
5.2.1 蛋白质标记方法
基于 MST 方法的蛋白质标记主要分为氨基标记与 His 标记两种。氨基标记法是用于标记和纯化分子质量超过 5 kDa 的蛋白的最优选择。其中，试剂盒中的 RED 染料所携带的 NHS-酯可以与一级氨基（赖氨酸残基）发生共价结合，适用于配置红光检测器（Nano 和 Pico）的 MonolithTM NT.115 系列和 NT.Automated 系列仪器。使用RED-tris-NTA 二代染料标记带有 His-tag 的蛋白或多肽。Monolith 二代 His-Tag 标记试剂盒可用于标记任何带有组氨酸标签的蛋白或多肽，能完成 500 次单点 MST 检测。标记仅需 30 分钟，无需去除过量染料。RED-tris-NTA 二代染料能够特异性结合至少有 6个组氨酸的 His-tags，亲和力高达几 nM。RED-tris-NTA 二代染料的最大激发光与发射光分别为 650 nm 和 670 nm。我们实验室对于 SHP2-WT 与 SHP2-E76K 蛋白最常用的标记方法是氨基标记法。
氨基标记法具体实验操作如下：
1) 缓冲液置换：轻轻倒置试剂盒中的 A 柱三次，使其中液体重新悬浮。拧下底部盖子，并取下上部瓶盖。将 A 柱放置于洁净的 1.5 mL 离心管内，1500 g 离心 1 min 去除柱中的液体，弃掉离心管中的液体并重新将 A 柱放置于离心管中。向 A 柱中心加入 300 µL 标记缓冲液 NHS（操作时小心将缓冲液直接加入到 A 柱中心的树脂膜，切勿使缓冲液沾碰柱子内壁或戳破树脂膜），1500 g 离心 1 min，弃去旋出液。将 A 柱重置于新的洁净的 1.5 mL 离心管中，取 100 µL 预先准备的 10 µM 高纯度蛋白样品置于离心柱中心树脂膜，1500 g 离心 2 min。此时蛋白样品已经收集到离心管中，可弃去使用过的 A柱；
2) 蛋白标记：取一只新的洁净的 1.5 mL 离心管，加入 7 µL 新配制的 RED-NHS 二代染料与 7 µL NHS 标记缓冲液，用移液枪轻轻吸打混合均匀，获得终浓度为 300 µM的染料溶液。另取一只洁净的 1.5 mL 离心管，加入 90 µL 准备好的蛋白样品（浓度 10 µM）。取 10 µL 的上述 300 µM 染料溶液加入到样品中，用移液枪轻轻吸打数次混合均匀，获得 100 µL 染料-蛋白溶液。此时溶液中染料浓度为蛋白浓度的三倍，室温下黑暗处避光孵育 30 min；
3) 平衡 B 柱：取下 B 柱顶部盖子，将其中液体倒出，随后取下下部盖子（将两个盖子放置一旁留用，切勿丢弃）。用提供的适配器替换 15 mL 离心管的盖子，将 B 柱从适配器顶部套入离心管中，在 B 柱中加满结合反应缓冲液，以平衡 B 柱，缓冲液在重力作用下流过树脂。弃去管中收集到的液体，继续重复该步骤三次。四个平衡步骤总共需要使用大约 8-10 mL 结合反应缓冲液。弃去最后一次管中收集到的液体后继续下一步实验。如果平衡 B 柱的实验完成后，30 min 的孵育还未结束，请将柱子的盖子重新盖上以防树脂失水变干；
主要结论与展望
展望
1) 化合物 11 在分子与细胞水平上对 SHP2 蛋白均有较好的活性与降解效率，但是目前尚未在动物水平上发现较好的效果。究其原因很有可能是大多数降解剂共有的不足之处：即在动物水平上 PK 较差。因此后续我们将继续与化学家合作进行结构优化改造，希望可以发现更多活性更好、具有成药潜力的靶向降解 SHP2 的候选化合物。
2) 改造化合物的同时，我们也将通过生物信息学手段寻找更多 SHP2 高表达的肿瘤细胞株，并以小分子降解剂为工具化合物，探索 SHP2 蛋白除酶活作用以外的其它功能。
3) 最后，我们要继续探索具有新母核结构的靶向 SHP2 突变体的相关小分子，也期望之后可以发现针对突变体有较好效果的小分子，为推动 SHP2 突变的功能研究提供新的研究工具。
参考文献（略）
