第一章 天师栗丰产栽培关键技术研究
1.3 嫁接实验方法
试验共 3 个处理：1）2 年生砧木；2）4 年生砧木；3）6 年生砧木。每个处理 50 株，10 株不嫁接为阴性对照如（表 1.1）。于 2019 年 3 月 23日进行嫁接，采用合接法（图 1.1）。管理水平一致，且在 2019 年 5 月底统一对嫁接部位加固，避免大风折断接穗。
嫁接后于 2019 年 4 月、5 月、7 月、9 月统计嫁接情况、开花结果情况。成活率=成活株数/嫁接株数*100%。采收期，统计每株天师栗产量，每株采收 10 个果实，称重，计算单果重。2020 年跟踪调查查一年，于 9月份调查存活情况及结果情况。
图 1.1 天师栗嫁接促进早果试验布置
第二章 天师栗叶绿体基因组测序及分析
1 材料和试剂
1.1 实验材料
样品来源于湖北十堰市丰溪镇，经湖北中医药大学药学院胡志刚教授鉴定为七叶树科七叶树属植物天师栗（A. chinensis var. wilsonii）。总共114 份天师栗样品，其中 75 株来自周家坝村，20 株来自辽叶村，19 株来自普龄村。选取健康已挂果的天师栗，于展叶期采集其幼叶，硅胶干燥带回实验室。
1.2 实验仪器与试剂
PL203 型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司）；JXFSTPRP-24 型全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；DK-8AXX 型电热恒温水槽（上海一恒科学技术有限公司）；微量移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）（德国 Eppendorf-艾本德股份公司）；GENE SPEED 1580R 型低温冷冻离心机（基因集团武汉晶中生物科技有限公司）；SCILOGXE MX-RD-E 长轴旋转混匀仪、Vortex KB3 漩涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）；EPS-600 型号电泳仪（上海天能科技有限公司）；Tgradient 梯度 PCR 仪（德国 Biometra 公司）；PHC-bi 高压蒸汽灭菌锅（日本 Panasonic-松下公司）；PHS-3C 型 PH 计（上海雷磁品牌供应商）；G: Box F3 凝胶成像系统（英国 Syngene 公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific-赛默飞世尔科技公司）。
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第三章 基于 SSR 标记与七叶皂苷含量的天师栗初级核心种质构建
1 材料和试剂
1.1 实验材料同第二章“1.1”。
1.2 实验仪器与试剂
同第二章“1.2”。
WG-136 电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、PL203 型万分之一电子分析天平、MS105/A 型十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）、JXFSTPRP-24 型全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）、5 mL 移液枪（大龙兴创实验仪器股份公司）、岛津 LC-20AD 型高效液相色谱仪（日本 Shimadzu 公司）、SB-5200D 型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）、SYZ- V系列超纯水机（武汉渗源仪器设备有限公司）、针式微孔滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）
甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、乙醚（分析纯，上海马陆制药厂）、磷酸（分析纯，武汉市江北化学试剂厂）、乙腈（纯色谱，Sigma Aldrich，美国）、超纯水、七叶皂苷钠化学对照品（中国药品生物制品检验所，批号：100346-201703，七叶皂苷 A 含量为 33.5 %，七叶皂苷 B 含量为 31.4 %）。
中药学论文
2 实验方法
2.1 天师栗 SSR 标记的遗传多样性实验方法
2.2.1 改良 CTAB 法提取 DNA
同第二章“2.1.1”方法。
2.2.2 DNA 检测同第二章“2.1.2”方法。
2.2.3 SSR 位点的检测和筛选
选择近缘种七叶树的其中 6 条染色体序列（chr1、chr10、chr11、chr12、chr13、chr14），使用 MISA 软件[47]进行 SSR 位点寻找。设置条件为：重复片段 1~6 个核苷酸，单核苷酸最小重复次数为 10 次，双核苷酸最小重复次数为 6 次，三核苷酸及以上最小重复次数为 5 次。
2.2.4 SSR 引物设计
使用软件 Primer 5[48]对包含 SSR 位点的序列进行引物设计。设计引物的条件为：引物长度 18~22 bp，（G+C）含量 40%~60%，退火温度 50~60℃，预期扩增产物长度 150~350 bp。随机挑选 65 对引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
2.2.5 SSR 引物筛选
随机选取 8 份不同村的天师栗的幼叶对 65 对引物进行 PCR 扩增。25µL 的 PCR 反应体系如表 3.1。PCR 反应体系如表 3.2。
用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物（图 3.1），选择单一条带、条带清晰、片段大小符合的引物用于后续检测。
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结语与创新
天师栗为种子类中药娑罗子基原植物之一，随着娑罗子在医疗、化工、园林观赏等方面的开发利用，市场对其需求量日益增大，应用价值较高。天师栗生产上存在挂果年限长、落花落果、种质混乱、栽培管理粗放等问题，已严重影响了药材的产量和质量。因此，速产、丰产、稳产、优质成为实现天师栗规范化种植的重要内容和亟需实现的生产目标。故本研究主要从嫁接促早果、保花保果、种质资源遗传多样性研究及核心种质库初步构建等方面进行了研究，以期为天师栗规范化生产及新品种选育提供理论参考。
本研究主要在以下三个方面取得进展：
1.通过嫁接试验使天师栗挂果年限提前，较自然挂果提前，实现了早产。同时为解决落花落果现象，筛选出 NAA+DA-6+叶面肥作为有效的保花保果配方肥，为丰产和稳产提供保障。以上关键技术的解决为天师栗丰产栽培和生产提供理论依据。
2.绘制了天师栗叶绿体基因组图谱。筛选出具有多态性的叶绿体非编码区片段、开发高多态性的 SSR 标记，对天师栗的遗传多样性进行了研究，为天师栗提供了更丰富的分子标记资源，为其分子辅助育种、新品种选育提供依据。
3.以 114 份天师栗为材料，基于 SSR 分子标记和药材品质进行初级核心种质库的构建，建立了包括 23 份种质的天师栗地方资源核心种质，占资源总数的 20%，天师栗初级核心种质库为后续研究提供了研究材料、为新品种培育奠定了基础。
参考文献（略）
