本文是药学论文，本文得出的结论主要包括以下几点：1.通过原位吸附法可成功将白藜芦醇装载于ZIF-8纳米颗粒，药物不仅仅存在于颗粒表面还可以进入内部空腔，其装载效率和投料比例、反应时间有关。药物装载过程不会影响ZIF-8纳米颗粒的形状、大小和晶型。并且在外界条件下对正常BMSC起到一定的保护作用。2.Resveratrol@ZIF-8纳米载药体系的药物释放具有pH依赖性。药物释放曲线表明所制备的载药体系因ZIF-8在中性和碱性环境中具有较好的稳定性，药物释放较慢；而在酸性环境下，因ZIF-8本身的分解，药物释放较快。3.通过双氧水处理细胞能够快速构建细胞衰老模型，处理后的细胞呈现衰老细胞的特征。针对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）而言，本文获得的较为适宜的处理参数为：c=200µM和t=3小时。4.Resveratrol@ZIF-8载药体系能较好地促进S-BMSC的生长，具有良好活性氧的清除能力，并能一定程度地恢复S-BMSC的成骨分化能力。此外ZIF-8作为载体同样适用于雷帕霉素、没食子酸等其他抗衰老药物，但对于其产生的作用仍需进一步的研究。本论文拟通过载药纳米给药系统克服药物易氧化和生物利用度低等问题，通过药物的释放抑制细胞扩增环节中的衰老。常见的抗衰老药物主要有，雷帕霉素[38]：它是由吸附链霉菌产生的天然化合物，于1970年左右在复活节岛土壤样品中被发现，是最广泛使用的衰老抑制剂。
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第1章绪论
虽然衰老是不可避免和不可逆转的，但衰老的过程和速度可被人为干预。常见的细胞衰老干预方法如下：1.制备低氧状态或添加活性分子、多酚药物分子来延缓细胞衰老。Eom等[34]利用FGF-2、FGF-4、EGF、HGF生长因子来维持骨髓间充质干细胞的干性。LiPengCheng等[35]利用低氧环境来增强胶质母细胞瘤癌症干细胞的干性。2.利用微载体实现细胞三维培养，即制备三维支架或凝胶为细胞提供适宜的生长环境，来达到延缓细胞衰老的作用。WeiJ等[36]利用三维水凝胶支架的制备，成功维持了小鼠胚胎干细胞的活性。3.基因修饰[37]：体外基因修饰可用于过度表达或敲除某些与衰老表达相关的基因，从而逆转衰老表型。其局限性在于，操纵过于复杂且无法保证正确率。然而以上体积的这些方法存在一些缺陷，如：活性分子的直接添加往往药物可控性较差，而三维培养方法存在收集效率低等问题。基于目前抑制细胞衰老方法的不足，2.姜黄素[39]：从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分。它可通过诱导外源性抗氧化酶或通过干扰各种细胞信号传导途径，包括凋亡相关和细胞周期蛋白、生长因子及其受体，来实现抗衰老。3.维生素E[40]：它是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是主要的疏水性（脂溶性）抗氧化剂之一。它可以通过与脂质过氧化链反应过程中产生的脂质自由基反应，保护细胞膜免受氧化损伤。
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第2章ZIF-8纳米颗粒的制备及表征
2.1引言
MOF的合成方法多种多样，但归纳起来可分为水热或溶剂热合成法[75-76]、微波辅助合成法[77]、机械化学合成法[78]、声化学合成法[79]、电化学合成法[80]、喷雾干燥法、反相乳液法和基于微流体的合成方法[81]等。本章以六水合硝酸锌和2-甲基咪唑为原料，分别以水和甲醇为介质，利用表面活性剂（十六烷基三甲基溴化铵（CTAB））和封端剂（三羟甲基氨基甲烷（TRIS））进行形貌调控，在常温下制备了沸石咪唑酯金属有机骨架8（ZIF-8）纳米材料，并对制备的样品进行结构表征，表征样品的形貌、粒径大小。摄入低剂量维生素E可起到抗氧化作用，但摄入大剂量时其抗氧化活性可能不复存在，因此时维生素E起到了促氧化作用，并妨碍其它脂溶性维生素的吸收。白藜芦醇[41]（包括反式白藜芦醇和反式-3,5,40-三羟基-二苯乙烯）：由于该分子的多效性，即具有下调多种信号通路的能力，引起了科学界的广泛关注。然而，雷帕霉素在抗衰老治疗中的应用仍存在一些问题。研究发现长期雷帕霉素给药会导致一些啮齿动物出现高血糖、葡萄糖耐受不良等问题。拓宽ZIF-8的制备方法，如利用微波辅助、反相乳液和基于微流体等方法，进一步探索不同制备方法对药物载体的效率的影响，并通过理论计算研究不同ZIF-8纳米载体和药物相互作用的机理。
2.2实验药品及其设备
以六水合硝酸锌和2-甲基咪唑为原料，分别以水和甲醇为介质，制备合成ZIF-8纳米颗粒。通过X射线衍射仪（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）对ZIF-8纳米颗粒进行晶体结构、形貌和粒径大小的表征。结果表明以甲醇为介质所制备的ZIF-8呈较为均匀的多面体形状，具有良好的结晶度；当以水为介质时，通过调控反应溶液的pH、表面活性剂CTAB以及TRIS浓度，可制备出具有花瓣状、鲁班锁状、球状、多面体状、针棒状、四面体状的ZIF-8纳米颗粒，颗粒尺寸小至90nm，大至700nm。结果证明随着CTAB浓度的增加，纳米颗粒尺寸减小，而TRIS溶液的浓度和pH大小会极大地影响ZIF-8纳米颗粒的形貌和大小。为了诱导细胞衰老，将BMSC在含有200μM过氧化氢的生长培养基培养3小时。用无血清的α-MEM洗涤细胞两次以去除残留的过氧化氢，加入新鲜的生长培养基重新培养，用于后续实验。这是因为载药体系释放的白藜芦醇含有的多酚类结构能抑制二硫化谷胱甘肽和羟自由基的形成，最终清除自由基和保护细胞免受氧化应激造成的损伤[46]。
实验设备列表
第3章载药ZIF-8纳米颗粒的制备及表征..........................................................17
3.1引言................................................................................................................17
3.2实验药品及其设备........................................................................................17
3.3实验方法........................................................................................................18
3.4结果与分析....................................................................................................21
3.5本章小结........................................................................................................28
第4章载药ZIF-8纳米颗粒抗细胞衰老的作用..................................................30
4.1引言................................................................................................................30
4.2实验用品及其设备........................................................................................30
4.3实验方法........................................................................................................31
第5章总结与展望..................................................................................................45
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第4章载药ZIF-8纳米颗粒抗细胞衰老的作用
4.1引言
在第3章中，我们成功将白藜芦醇装载在ZIF-8纳米颗粒中，构建了Resveratrol@ZIF-8载药体系。本章将对ZIF-8的细胞相容性及Resveratrol@ZIF-8载药体系在抑制细胞衰老方面的作用进行研究。但当Resveratrol@ZIF-8的载药体系的浓度超过一定范围（>30μg/mL），其促进衰老细胞生长的效果大大降低，甚至出现了抑制衰老细胞生长的情形。这很大程度是因为，当Resveratrol@ZIF-8载药粒子浓度达到一定范围后，其载体ZIF-8纳米粒子会对细胞产生了较大的毒性，抵消了药物的作用。因此我们在后续的实验将载体浓度选择为30μg/mL。通过双氧水刺激正常小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）成功构建了体外衰老细胞模型。利用CCK8法研究了ZIF-8纳米颗粒的细胞毒性以及载药体系对衰老小鼠骨髓间充质干细胞（S-BMSC）增殖的影响和对细胞体内ROS的清除能力。结果表明，Resveratrol@ZIF-8载药体系能较好地促进S-BMSC的生长，具有良好的活性氧的清除能力，并能一定程度地恢复S-BMSC的成骨分化能力。最后我们制备了Rapamycin@ZIF-8、Gallicacid@ZIF-8载药体系，并考察了两者在促进衰老BMSC（S-BMSC）生长的能力，来探究ZIF-8作为载体是否对于其他抗衰老药物具有相同的作用。结果表明ZIF-8作为药物载体同样适用于其他抗衰老药物，但对于其产生的作用仍需进一步的研究。
ZIF-8纳米颗粒的SEM（a）和TEMM（b）照片
4.2实验用品及其设备
因体外培养的细胞仅具有有限的增殖潜力，连续多次传代细胞将进入复制衰老状态。衰老的自由基理论预测，在正常的有氧代谢过程中产生的活性氧自由基（ROS）会破坏生物分子，最终导致组织功能下降和细胞衰老[29]。除复制性衰老外，外界刺激亦会导致细胞衰老。因此，各种氧化应激方法或试剂已被用于诱导细胞衰老，包括高氧血症[30]、暴露于过氧化氢[31]、紫外线辐照（UV）[32]、叔丁基过氧化氢[33]。其中，过氧化氢可使细胞产生氧化应激，可在在短时间内诱导细胞老化。用此法获得的衰老细胞显示出许多与复制性衰老细胞相似的特征[30]。氧化应激诱导的细胞衰老被广泛应用于细胞衰老方面的相关的研究，是一种典型的衰老细胞模型。因此本文将利用过氧化氢来诱导细胞衰老，构建体外细胞衰老模型。具体步骤如下：1.将BMSC置于75cm2细胞培养瓶在37︒C和5%CO2的条件下培养。2.待细胞达到90%融合后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养瓶中消化下来，制成细胞悬液，并以1万细胞/孔的密度接种到96孔板中。3.为了验证Resveratrol@ZIF-8载药体系促进衰老BMSC（S-BMSC）生长的能力，在本章中，我们将衰老细胞与载药体系共培养并考察衰老细胞的增殖实验。图4.4是S-BMSC与不同浓度的Resveratrol@ZIF-8共培养1、3、5、7天后的增殖结果。从图中可以看出，粒子浓度在一定范围内（10-30μg/mL），Resveratrol@ZIF-8的载药体系可以很好地促进S-BMSC的生长，并呈现浓度依赖趋势，即随着浓度的增加，促进效果愈加明显。
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第5章总结与展望
本文成功制备了Resveratrol@ZIF-8载药系统，并初步证实了Resveratrol@ZIF-8载药体系能够一定程度地抑制细胞扩增环节中的细胞衰老。但本文仍存在一些不足，主要体现在药物的装载效率尚低、对载药系统增强衰老细胞功能的表征尚浅、纳米载药体系抗衰老的具体机制尚不明确。为了解决以上问题，本人认为后续的工作应该从以下几个方面入手：1.本文只研究一种ZIF-8纳米粒子对抗衰老药物的装载效果，后续工作可以通过调整ZIF-8的合成参数，调控其形状和大小。鉴于纳米粒子形状和大小的细胞行为具有重要的影响，研究不同类型ZIF-8纳米粒子的药物装载效率及所构建的纳米载药体系对抑制细胞衰老的作用具有重要意义。2.进一步完善体外细胞实验，深入表征纳米载药体系在增强衰老细胞功能以及在保护正常细胞免受外界氧化损害方面的作用。在基因层面本文只评价了SP7基因，后续实验可全面考察载药体系对其它和干细胞成骨分化相关的基因的表达情况；同时还可以考察其是否能够增强老化BMSC向成脂肪方向分化的能力。4.纳米载药体系对抗细胞衰老的可能机制有两个：纳米载药体系被细胞吞噬进入在细胞溶酶体后释放药物，或通过在细胞培养过程中直接将药物缓慢释放至培养基中起到抗衰老作用。后续实验可通过荧光标记结合荧光共定位、透射电子显微镜定性观察进一步考察细胞和纳米载药体系的作用。
参考文献（略）
