本文是药学论文，本文主要完成的工作包括以下几个方面：一、本研究首次报道了天然产物葫芦素类的主要成分葫芦素B和葫芦素E，在安全剂量下可促进血管内皮细胞在基质胶3D培养下的管腔形成，并观察到低剂量的葫芦素B和葫芦素E可修复斑马鱼胚胎的血管损伤。我们首次发现葫芦素B和葫芦素E可以特异性活化VEGFR2Tyr996位点，是一种潜在的VEGFR2激动剂。而且，低剂量下的葫芦素可通过活化其下游与血管内皮细胞增殖有关的信号蛋白Akt、Erk1/2、PLCγ、p38，与血管内皮细胞迁移相关的信号蛋白FAK、Src，从而促进血管内皮细胞的增殖及出芽。通过生物信息学的分析，我们推测，葫芦素类的小分子，主要通过作用于天然免疫及细胞代谢相关的蛋白信号分子发挥其药理学作用。
....
第1章绪论
健康成人体内，成骨细胞所介导与破骨介导的骨吸收维持着正常的骨代谢状态。近年来的多项研究表明，成骨途径中骨形成与血管形成具有协同作用。软骨内骨化过程是典型的成血管-成骨偶联的生理过程。软骨内骨化始于破骨细胞、血管和骨祖细胞侵入已有的软骨板[50]。L型血管中内皮细胞的数量不随年龄而改变，H型血管内皮细胞的数量则与年龄相关[39]。在老年动物中，H型血管和血管周围骨祖细胞均有减少，而内皮细胞的总数却没有明显减少[51]。此外，在绝经前的骨质疏松症小鼠模型中，H型血管相应减少[52]。衰老小鼠的血流减少可能与骨形成减少和H型血管丢失有关[41,53]。这些生理现象，都反映出骨组织中，骨形成与其特异性血管之间的密切联系。近期的研究结果显示，在敲除了血管形成因子SLIT3负性调控蛋白SHN3后，成骨细胞分泌更多的SLIT3，促进H型血管的形成；反之，在成骨细胞或骨细胞特异性基因敲除的小鼠模型中，SLIT3的缺失则可减少H型血管的形成，进而导致骨形成速率的下降和骨质疏松表型的出现。H型血管本身并不生成SLIT3这一血管生成因子，而只大量表达其受体基因Robo1，而Robo1基因敲除小鼠同样呈现H型血管的形成减弱和骨质疏松表型。
.......
第2章葫芦素主要成分体外成血管功效的验证及作用机制探讨
2.1引言
本研究在课题组前期研究的基础上，对其在血管新生方面的量效关系进行了深入研究，明确了药物在人脐静脉血管内皮细胞中的安全剂量，筛查了一系列浓度下，葫芦素B和葫芦素E对EA.hy926细胞三维培养中管腔形成的影响，并在斑马鱼血管损伤在体模型中验证了药物低剂量下的血管修复作用。通过对血管新生重要信号通路分子活性的检测，揭示该药物促进内皮细胞体外管腔形成的分子机制，应用生物信息学工具对该药物可能存在的蛋白靶点进行了预测和聚类分析。
2.2实验材料与设备
水浴锅37°C预热，准备好细胞所需的完全培养基，温浴到37℃。从液氮中取出冻存的细胞，先将其置入-80℃冰箱，使得冻存管中的液氮挥发掉。将冻存管迅速转移至37℃水浴中，快速晃动使管中内含物尽快融化。完全融化后，用75%的酒精擦拭冻存管外表面。在生物安全柜中打开冻存管，将细胞冻存悬液转移至装有4mL完全培养基的15mL离心管中。将细胞悬液1000rpm离心5min后，尽量去除上清液，加入1~2mL已预热到37℃的完全培养基，轻轻吹打混匀细胞沉淀。将细胞全部接种到1个T25培养瓶中，加入足量的完全培养基。轻轻摇晃细胞培养瓶使细胞均匀分布。放入37℃，5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
......
第3章含葫芦素B和葫芦素E的载药复合支架的制备与表征.....43
3.1引言.................................................................................................................43
3.2实验材料及主要设备.....................................................................................44
第4章PT/CuB和PT/CuE支架修复大鼠颅骨缺损的实验研究.....61
4.1引言.................................................................................................................61
4.2实验材料及设备.............................................................................................62
4.3实验方法.........................................................................................................64
第5章结论与展望..............................................................................83
.....
第4章PT/CuB和PT/CuE支架修复大鼠颅骨缺损的实验研究
4.1引言
大段的骨缺损，尤其是缺损部位血管供应受损，常常导致骨不连。在过去研究的骨植入支架中，支架周围多余的基质沉积抑制支架内的血管生成，从而导致细胞坏死，组织修复的失败[199]。因此，骨组织工程最大挑战之一是血管化骨支架的开发。新一代的组织工程策略，除了模拟缺损组织的形态外，添加有效的成分，刺激足够的血管新生，诱导骨组织填充缺损部位至关重要[3,69]。为了促进血管的新生和骨沉积，目前已经有各种方法用于促进植入物的快速血管化，例如，含有肽或生长因子的功能化生物材料、超多孔支架，以及种子细胞的植入[2,48]。目前已报道了多种诱导分子可诱导及加速血管新生。然而，由于毒副作用，稳定性差等各种原因，很多生长因子、药物等在临床转化中失败[2]。例如：由于生长因子在体内的半衰期非常短，尤其是在骨折等疾病中，组织微环境不利于活性蛋白发挥生物学功能[120]。由于这些生物因子的稳定性差，通常需要高剂量给药才能发挥其治疗效果，这不仅增加治疗成本，而且也会引发毒副作用，影响植入后支架的作用效果；添加细胞时，细胞的来源、体外操作的规范、严格的监管批准程序以及高昂的成本限制了该技术的广泛应用[200]。
4.2实验材料及设备
本动物实验采用雌性12周龄（200~300g）Wistar大鼠，数量40只，实验动物购买于北京维通利华公司。饲养在标准SPF级大鼠房，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2017-0172。课题中所有动物实验操作均符合中国科学院深圳先进技术研究院的动物伦理相关规定，并通过伦理审查委员会核准后进行。术后给予青霉素（7U/kg）连续注射三天防止手术部位感染。之后对大鼠切口愈合、炎症反应以及有无排异等情况进行记录观察。植入材料观察时间为8周，处死前12，13天和2，3天称重大鼠并皮下注射钙黄绿素（25mg/kg），以绿色荧光标记骨形成，并继续在正常饲养笼中单独饲养大鼠。其中，钙黄绿素用等渗碳酸氢钠溶液配置成浓度为20mg/mL，0.22μm过滤器过滤后使用。手术8周后，根据检测指标分组取材。其中每组取3只大鼠用于Micro-fil灌注观察血管。其余的均取大鼠颅骨，入福尔马林固定后，进行X-Ray及CT扫描分析，影像学扫描分析后，取3只大鼠样本，做硬组织切片包埋。其余样本脱钙后进行石蜡包埋切片，进行常规病理分析及免疫组化染色。
.......
第5章结论与展望
血管新生是创伤修复中的重要过程，快速有效的血管新生决定了创伤性疾病的转归。在缺血性疾病及创伤修复中，寻找稳定、高效且毒副作用小的促血管新生的活性物质是研究的热点。本研究基于“老药新用”的研究理念，首次发现了一种已在临床应用的四环三萜类天然药物葫芦素在血管新生方面的新功效。论文通过多学科交叉，探索了低剂量葫芦素促血管新生的作用机制以及在骨组织工程领域方面的应用。二、基于骨组织工程技术，本研究使用3D低温成型技术制备了含葫芦素的载药复合支架。本研究所制备的支架，结构均匀，孔隙率高，扫描电镜下可见材料表面光滑，细胞在支架表面黏附良好。药物在支架体外降解模拟实验中呈线性释放，并且释放液中药物的生物活性稳定。该部分所制备的载药支架，保留了传统支架多孔及骨诱导的特征，在此基础上加入了促血管新生的药物分子，使得药物可在植入体内后局部缓释。该制备工艺稳定、可靠，为药物在骨缺损修复中的应用提供了使用途径。
参考文献（略）
参考文献（略）
