苦参对主要致龋细菌、生物膜的实验研究

本文是药学论文，苦参对食源性病原体和其他引起传染病的生物具有抗菌和抗病毒活性的许多证据来自基于体外细胞的测定法，因此有必要通过人类临床试验进一步证实其体内功效。因此，有必要使用不同浓度的苦参进行更多对照试验，以验证其对体内致龋菌群的作用。在本研究的范围内，可以得出结论，苦参可以有效的抑制主要致龋细菌浮游和生物膜状态下的生长、黏附、产酸和产糖。后期需在动物模型下进行进一步研究，探究其对主要致龋细菌抑制的机制等，并为进一步临床试验提供基础。以确定苦参作为牙菌斑微生物的治疗和预防龋齿治剂的真正益处，并确定苦参中可用作抗龋齿/抗牙菌斑剂的特定活性成分以及可用于人类的更安全剂量。据Park[54]等人研究发现与单物种生物膜相比，多物种生物膜更紧密地模拟了口腔的状况，因此，多种生物膜具有许多优势。首先,它们将污染的可能性降到最低,并提高了可重复性；第二,它们比单菌种生物膜形成更厚的生物膜和更复杂的网络结构；第三，其相比较于单菌生物膜对抗各种微生物抑制剂表现出更高的抵抗力。尽管我们的测定方法仅评估单菌种的生物膜而存在局限性，但此实验中消除了浮游细菌的影响，避免其对已存在的微生物膜的形成是必要而且重要的。从此层面上讲，本文报道的结果极为相近：它们证明了苦参具有潜在的用途。

前言

苦参的主要成分氧化苦参碱[26]和苦参碱[27]是喹嗪类的生物碱，能在一定程度上抑制革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌和梭状芽孢杆菌）和革兰阴性菌（绿脓杆菌和大肠杆菌）等病原微生物，而上述的致病菌的生理生化等特性均比较复杂，苦参中的成分却对其有一定的抑制能力，可见其具有相当高的研究价值，而其对主要致龋细菌作用的相关研究较少，故可行进一步的研究对口腔微生物的影响。变形链球菌是龋齿发生最密切的致病菌之一[28]；嗜酸乳杆菌亦黏附于牙面并聚集参与牙菌斑生物膜的形成[29]，分泌大量的细菌素杀伤其他细菌，能高效代谢糖类产酸而且本身可以耐酸[4]；血链球菌产生对氨基苯甲酸能够促进变形链球菌定植生长；以上均提示着龋齿的发生是不同细菌共同参与且过程复杂。众所周知细菌在浮游状态下和生物膜状态下相比在毒力、抗药性抵抗宿主免疫防御能力均较弱，而微生物却以生物膜为主要形式存在，因此不仅研究药物对浮游菌的作用且更要致力于研究对生物膜状态的影响。故本实验拟研究苦参对主要致龋细菌浮游和生物膜状态下的生长、代谢的作用，为后续的进一步研究能够提供资料支持和相关基础理论依据。

研究内容与方法

1研究对象

苦参(SophoraflavescensAit.)：于新疆参茸中维药饮片有限公司购买苦参药材。变形链球菌(StreptococcusmutansUA159)、远缘链球菌(Streptococcussobrinus6715)、血链球菌(StreptococcussanguisATCC10556)、黏性放线菌(ActinomycesviscosusATCC19246)、内氏放线菌(AetinomycesnaeslundiiATCC12104)、嗜酸乳酸杆菌(LactobacillusacidophilusATCC4356)。苦参与CHX相比在抑制生物膜形成能力上有显著优势，即使与高浓度的细菌(107CFU/mL)共同培养，也能够完全阻止体外主要致龋细菌生物膜的形成。本研究使用的是由单菌物种组成的生物膜的测定方法可能有其局限性。

2材料与方法

取干燥苦参药材适量粉碎过60目筛，用蒸馏水以质量:体积=1:10的比例于摇床上水平振荡浸泡20min后，将玻璃锥形瓶再置于条件为80℃，100W，45min的超声振荡仪中，抽滤，将滤渣进行二次提取，合并两次滤液并旋转蒸发浓缩[30]至半粘稠状后在真空下冷冻干燥(－80℃)，得黄白色粉末，用蒸馏水配制母液浓度为64g/L，过0.22无菌滤过器避光储存于4℃冰箱备用。细菌复苏：变形链球菌、血链球菌、远缘链球菌、内氏放线菌取出冷冻管后，于37℃水浴锅中1min内快速融化。用接种环蘸取一环菌液放入3mLBHI液体培养基中，于37℃下厌氧培养48h。黏性放线菌、嗜酸乳酸杆菌分别放入3mLBHI、MRS液体培养基中，于5%的CO2，37℃恒温培养箱培养48h.将各菌株接种于琼脂平板(BHI或MRS)，相同条件下再次培养24h，观察菌落的颜色及形态，从中挑取具有典型形态的单个菌落行革兰染色并在油镜(×100)下观察细菌的形态.挑取单个菌落于BHI、MRS液体培养基在相同条件下过夜培养24h增菌，使用分光光度计调定菌悬液浓度为107CFU/mL(OD630nm=0.2)备用。将菌株储存在细菌冻存管内,－80℃下储存。

前言………………………………………………………………………………3

研究内容与方法…………………………………………………………………5

1.研究对象…………………………………………………………………5

2.材料与方法………………………………………………………………5

3.质量控制…………………………………………………………………10

4.统计学方法………………………………………………………………10

5.技术路线图………………………………………………………………10

结果………………………………………………………………………………11

讨论………………………………………………………………………………20

小结………………………………………………………………………………23

讨论

通过本实验发现苦参对主要致龋细菌的MIC为4g/L，在此浓度下能够抑制主要致龋菌黏附率达60%以上，并明显抑制浮游细菌产酸及合成IEPS。此外在MIC浓度下也能明显抑制主要致龋细菌的单菌生物膜形成并优于0.5g/LCHX；2MIC浓度下对变形链球菌和内氏放线菌的单菌生物膜清除能力优于0.5g/LCHX，达到70%左右，而其余细菌是在4MIC浓度下单菌生物膜的清除能力优于0.5g/LCHX，达到80%以上。在MIC浓度下均能抑制单菌生物膜产酸和合成IEPS，2MIC浓度下明显抑制单菌生物膜产酸和合成IEPS，抑制率分别为64.5%-94.1%和42.3%-60.0%。苦参为豆科槐属植物，人们通常将其干燥根入药，具有清热除湿、杀虫和利尿的作用[38]；苦参内的成分能够抑制不同病原细菌（如大肠杆菌[39]和白色念珠菌[40]）、抗病毒[41]、调节神经和免疫等诸多药理作用，同时还具有治疗肺纤维化[42]的功效；现临床中已运用了复方苦参注射液及苦味健胃剂等单一成分或复方成分制剂。因其典型的结构和生物活性的多样性被诸多学者广泛关注，同时发现苦参中含有生物碱、黄酮类、木质素等主要生物活性成分并发挥相关功能作用。李媛媛[43]等研究发现氧化苦参碱24h对大肠埃希菌的MIC为24.75g/L；朱彩莲[44]等发现苦参24h对牙周致病菌的MIC在0.106-10g/L；在本实验中苦参24h抑制主要致龋浮游菌的MIC值均在4g/L并在4g/L浓度下能明显的抑制浮游菌的产酸和产糖，可见其在调控主要致龋细菌的产酸和产糖具有一定优势。

小结

1苦参对主要致龋变形链球菌、远缘链球菌、血链球菌、黏性放线菌、内氏放线菌和嗜酸乳酸杆菌在浮游状态下的生长、黏附、产酸和合成水不溶性胞外多糖具有明显的抑制作用。2苦参在低浓度下不仅能够明显抑制主要致龋变形链球菌、远缘链球菌、血链球菌、黏性放线菌、内氏放线菌和嗜酸乳酸杆菌的生物膜形成，而且也能够明显的清除其已形成的单菌生物膜。同时苦参能够明显抑制以上致龋细菌产酸和合成水不溶性胞外多糖。
参考文献（略）