本文是一篇药学论文，药学专业学生主要学习药学各主要分支学科的基本理论和基本知识，受到药学实验方法和技能的基本训练，具有药物制备、质量控制评价及指导合理用药的基本能力。（以上内容来自百度百科）今天为大家推荐一篇药学论文，供大家参考。
前 言
位于江淮之间安徽省西部的大别山，属于亚热带北缘，由于其特殊的地理位置和气候环境，成为安徽省石斛属药用植物的主要分布区域[1]。其中，霍山石斛Dendrobium huoshanenese Tang et Cheng 为兰科 Orchidaceae 石斛属 Dendrobium 植物，又称“米斛”，仅分布于大别山区，为该地区的特有种。除霍山石斛之外，大别山区还分布有铁皮石斛 Dendrobium officinale、铜皮石斛 D.moniliforme 和河南石斛D.henanense。霍山石斛作为一个独立的物种，对于石斛属的系统发育和物种多样性研究具有重要的意义，有一定的科学价值。现代研究表明，霍山石斛在抗氧化[2]、抑制肿瘤活性[3]、延缓白内障[4]和保肝[5]等方面具有明显的药理活性，且在保健领域，也一直被人们所关注，具有一定的药用价值、食用价值和经济价值。由于霍山石斛生长环境独特，加上人工过度采集，使得其野生资源已濒临灭绝，难以满足市场的需求。随着近年组培技术的应用，霍山石斛的人工栽培得以实现，大别山区已经开始大面积栽培霍山石斛，目前已形成 5000 亩左右的种植面积。霍山石斛的疗效独特且价格昂贵，市场上出现了用其他石斛冒充霍山石斛的情况。而位于大别山区的其他三种石斛因为在形态上与霍山石斛相近，最容易作为霍山石斛的伪冒品出现于市场中。特别是在形态上就难以区分的河南石斛，若加工成“枫斗”，就更加难以和霍山石斛区分。
为了保障市场上霍山石斛的安全可靠性，必须建立一个对霍山石斛有效的鉴别方法。然而，形态、显微及化学成分等传统的鉴定方法，耗时长，所需专业技能要求较高，且易受地理环境、生长期、储存条件等诸多因素的限制，从而影响到鉴别的准确性。而分子生物学鉴定方法，需要用到分子标记，但所用分子标记的种类和方法有很多[6-7]，主要包括蛋白质标记和 DNA 标记。蛋白质标记容易受到个体生长期、生长环境的不同而表达的种类和数量不同的限制，而利用 DNA 特异性变异位点和微卫星（SSR）标记的特异性快速 PCR 鉴别方法就没有以上利用蛋白质标记进行鉴定的局限性，其具有重复性好、易于操作、结果可靠等优势，目前正被越来越多地应用于物种的鉴定当中[8-9]。同时，上述分子生物学鉴定方法能够以个体间遗传物质 DNA 序列变异为基础的遗传分子标记对物种进行鉴定，与其他几种传统的鉴定方法相比，具有其 DNA 在植物体的各组织、各发育时期均可检测到，不受季节和环境限制，多态性高等优点。而且，对于霍山石斛这种资源濒危的物种来说，所需的样本量少也成为分子生物学鉴定的一大优势。因此，利用 DNA 为标记的分子生物学鉴定方法能够满足对霍山石斛进行快速、准确和有效鉴定的迫切需要。随着分子标记技术的发展，越来越多的分子标记被应用到霍山石斛的鉴别当中。目前，DNA 条形码作为中药分子鉴定中的热点，被广泛关注。DNA 条形码是由加拿大动物学家 Hebert[10]首次提出，以一段 DNA 片段对物种进行鉴定。随后，生命条形码联盟（CBOL）对陆地 907 个植物样品进行研究，认为 rbcL 和 matK 片段具有很好的分辨能力，将这两个片段联合作为陆地植物的 DNA 条形码[11]，Haruka Asahina[12]等利用 rbcL 和 matK 对石斛属的 5 种石斛进行了鉴别。中国植物条形码工作组[13]对 1757 个种的序列分析发现，ITS2 和 psbA-trnH 片段具有更好的鉴定能力，因此，将 ITS2+psbA-trnH 联合片段作为中药分子鉴定的通用条形码。在霍山石斛的分子鉴定当中发现，单一的 DNA 片段或者 ITS2+psbA-trnH 联合片段难以将枫斗类石斛中的霍山石斛和铜皮石斛分开，通过对霍山石斛和铜皮石斛的 nrDNA ITS 序列比对发现，大多数霍山石斛与铜皮石斛共享同一种单倍型[14]。面对这个问题，有人提出在原有的基础之上，增加霍山石斛的线粒体 DNA 片段，分别以 nrDNA ITS 和 nad1-intron2[14]，或 ITS、Nad-intron2 和 psbA-trnH 序列[15]作为新型的联合片段。除了 DNA 条形码之外，也有通过对霍山石斛某一段特异性序列进行扩增来鉴定霍山石斛，刘石泉[16]等通过对石斛属植物基因库中 rDNA ITS序列数据库进行同源性比较，在与霍山石斛差异较大的区段设计一对特异性引物来鉴别霍山石斛与同属的其他石斛。刘明珍[17]等利用 ISSR 分子技术对霍山石斛及霍山产的铁皮石斛和铜皮石斛进行了鉴别。对于霍山石斛的微卫星的开发在 HuiWang[18]和郑基阳[19]有过报道，但也只是对霍山石斛不同居群的遗传多样性进行究，并未用微卫星位点进行霍山石斛的分子鉴定。
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第一章 特异性 PCR 鉴别霍山石斛
霍山石斛 Dendrobium huoshanenese Tang et Cheng 为兰科植物，又称“米斛”，仅分布于大别山区，为该地区的特有种。除霍山石斛之外，大别山区还分布有铁皮石斛 D. officinale、铜皮石斛 D. moniliforme 和河南石斛 D. henanense。在实际调查中发现，该地区生长的四种石斛形态相似，亲缘关系相近，特别是河南石斛和一年生的铜皮石斛，在外观形态上，难以与霍山石斛进行区别。此外，除鲜条之外，石斛类药材还常以加工成“枫斗”的形式出现在市场中，就更加难以在外观形态上进行鉴别，增加了鉴别难度。本研究依据霍山石斛、铁皮石斛和河南石斛的 ITS 序列上的变异位点，设计特异性鉴别引物，对霍山石斛进行特异性 PCR 鉴别，为霍山石斛的快速鉴别提供技术支持，完善霍山石斛的鉴别体系，也为维护市场中的公平交易奠定基础。
1 材料与方法
Taq DNA Polymerase 上海生工生物有限公司Hot Start Taq DNA Polymerase 上海生工生物有限公司Taq Plus DNA Polymerase 上海生工生物有限公司dNTPs 上海生工生物有限公司DNA marker B（100-600 bp） 上海生工生物有限公司DNA marker D（100-2000 bp） 上海生工生物有限公司琼脂糖 M 上海生工生物有限公司6×Loading Buffer 上海生工生物有限公司
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1.2 实验方法
1.2.1 DNA 提取
采用 CTAB.法提取总 DNA[20]。CTAB.（hexadecyltrimethylammonium bromide）是阳离子表面活性剂，可将植物细胞表面的细胞膜溶解。同时能与核酸结合，形成复合物，在高盐溶液中解离，从而使 DNA 和多糖物质分开。而当溶液中的盐浓度降低时，CTAB.与核酸形成的复合物又可从溶液中析出，形成沉淀，随后通过离心将 CTAB.-核酸的复合物与蛋白类、多糖类物质分开。本实验所有样品均称取约 70mg 的植株叶片或茎，无菌水冲洗，加入 CTAB.缓冲液 A、β-巯基乙醇和少量 PVP，球磨机研磨，置于 65℃水浴 2 h；加等体积的氯仿/异戊醇，混匀成乳状液，室温下离心；静置分层后，取上清液，加入 700 ul氯仿/异戊醇，混匀，离心；吸取 500 ul 上清液，加入 330 ul 异丙醇，-20℃放置 1 h；离心弃上清；分别先后加入 70%乙醇和无水乙醇，使沉淀悬浮起来，离心弃上清；37℃挥干乙醇，加 70 ul 灭菌水，溶解 DNA。取部分所得 DNA 样品稀释 70 倍在紫外可见光分光光度计上测定波长 260 nm 和 280 nm 处的吸光度，根据 A260 换算提取 DNA 浓度，A260/280 比值判断浓度。剩余 DNA 样品于-20℃保存备用。
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第三章 霍山石斛和铜皮石斛的 SNP 位点开发.....48
1 材料与方法....... 48
1.1 样品采集............ 48
1.2 DNA 提取 ........ 49
1.3 高通量测序分析.......... 50
2 结果......... 53
2.1 测序结果评估.... 53
2.2 SNP 检测和注释 .......... 54
2.3 InDel 检测和注释......... 55
3 讨论......... 55
全文总结与展望.........57
1 全文总结........... 57
1.1 霍山石斛特异性鉴别研究.... 57
1.2 霍山石斛微卫星位点开发.... 57
1.3 SNP 位点开发 .... 58
2 展望......... 58
第三章 霍山石斛和铜皮石斛的 SNP 位点开发
SNP（Single Nucleotide Polymorphism）是单核苷酸变异位点，为第三代分子标记技术，其变异类型包括单碱基的插入/缺失，或转换（一种嘧啶突变成另一种嘧啶或一种嘌呤突变成另一种嘌呤），或颠换（一种嘧啶突变成一种嘌呤）等，具有遗传稳定性高、基因组分布广泛、包含信息量高、检测方法多样等特点[54]。一般的SNP检测技术，如基于构象的变性梯度凝胶电泳（DGGE）、单链构象多态性（SSCP）；基于分子杂交的基因芯片（Gene chips）；基于酶切或PCR反应的PCR-RFLP、突变错配扩增检验（MAMA），高分辨熔解曲线（HRM）等，都能够有效的检测出SNP位点[55]。但是，所得到的位点数量少，无法满足疑难物种鉴别、精细遗传图谱构建和分子育种等的需要。DNA测序技术是一种直接的方法，随着测序技术的发展，高通量测序技术的普遍，通过对不同物种基因组的直接测序比对，理论上可获得全部的SNP位点。#p#分页标题#e#
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总结
基于 ITS 序列，以菱唇石斛为外类群，构建系统发育树，结果表明：霍山石斛、铁皮石斛和河南石斛都各自聚为单系（自举值和后验概率值分别为 BS=0.90，PP=67；BS=1.00，PP=100；BS=0.98，PP=98），ITS 序列能够作为霍山石斛及其伪品铁皮石斛和河南石斛的 DNA 鉴别条形码。在本研究中，依据 ITS 序列上变异位点，共设计筛选得到了 3 对特异性鉴别引物可对霍山石斛及其伪品铁皮石斛和河南石斛进行准确鉴别。其中，引物 SH-CP25s/SH-CP25a 可鉴别霍山石斛与铁皮石斛；SH-CP29s/SH-CP29a 可鉴别霍山石斛与河南石斛；而引物 SH-CP9s/SH-CP9a可鉴别霍山石斛和铁皮石斛与河南石斛。此外，在反应条件优化的过程中，引物SH-CP25s/SH-CP25a 和 SH-CP29s/SH-CP29a 在退火温度 55℃时，就可得到较好的鉴别效果，而引物 SH-CP9s/SH-CP9a 反应退火温度在 58℃时，才可有效鉴别。研究结果为霍山石斛的快速鉴别，维护市场公平交易奠定了基础。
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参考文献（略）
