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前 言
寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）近年来持续的爆发与肆虐，已经严重危害到人类的健康与种族的繁衍。寨卡病毒最初于 1947 年[1]在乌干达的森林中被发现，但其在过去几十年中一直被忽视。自 2007 年以来，寨卡病毒已经传播到太平洋[2-5]与美洲地区[6-8]，并导致疫情爆发和流行。更重要的是，寨卡病毒感染与先天性小头症[9-12]和格林-巴利综合征[3,13]有关。寨卡病毒感染性克隆的发展，对于解决寨卡病毒危机起到至关重要的作用[14,15]。然而，众所周知，黄病毒基因组的 cDNA 在常见的大肠杆菌宿主[16-20]中具有毒性并且极不稳定，主要是因为病毒 cDNA 中原核启动子的毒性病毒蛋白的表达[19,20]。这种现象严重阻碍了黄病毒感染性克隆的发展[16-18,21]。为了解决这个问题，研究人员已尝试了许多不同的方法。黄病毒的早期反向遗传学系统的建立通常是基于病毒 5′cDNA 片段和 3′cDNA 片段的体外连接[17]，而该策略现在仍在使用[22,23]。为了构建全长黄病毒感染性克隆，通常需要对不同大肠杆菌菌株进行筛选[17]，优化病毒 cDNA 片段的装配顺序[18]。通过在病毒 ORF 中引入沉默突变来产生一些感染性克隆，以消除病毒 cDNA 中的隐性原核启动子的作用[19]。另一项研究表明，将包含多个终止密码子的短间隔序列引入到编码包膜蛋白的末端区域，可以有效地稳定 DENV3[24]的 cDNA 克隆。而最近报道的两个构建 ZIKV感染性克隆的策略中[15,26]，体内剪接的短真核内含子也被用于稳定黄病毒 cDNA克隆[25]。
P.li.LSUI2 group II 内含子最初发现于棕色藻类 Pylaiella littoralis 的线粒体基因组中的核糖体 RNA 大亚基基因[27]。像许多其他 group II 内含子一样，P.li.LSUI2内含子编码具有逆转录酶和 RNA 修饰酶活性的内含子编码蛋白（IEP）[28]，这是体内自我剪接和回归归巢所必需的[29]。在体外反应条件下，P.li.LSUI2 内含子在自剪接反应中显示出高效性，而现有的研究已经对其催化机理进行了较为彻底的了解[30,31]。基于 P.li.LSUI2 的这些优点，我们将探索其在构建稳定的 ZIKV 感染性克隆中的应用。
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1. 寨卡 GZ01 株病毒全长感染性克隆的设计与构建
根据 ZIKV GZ01 株全基因组测序结果，结合 Genbank 中收录的 ZIKV 全基因组序列以及酶切位点分析，设计引物进行 RT-PCR 扩增。对低拷贝载体 pACNR进行多克隆位点的改造并命名为 pACNR-Linker。设计一段长 70bp 的 DNA 片段，其中依次包含 Not I、Kpn I、Kas I、BstE II、Xho I 酶切位点，克隆至 pACNR- Linker中。将 ZIKV GZ01 株全长分为四段进行 RT-PCR 扩增，在 5′ 末端加入 SP6 启动子序列，并依次连接至 pACNR-Linker 中，为了解决 ZIKV GZ01 株感染性克隆对宿主菌株的毒性问题，在设计的第一条片段的对应 E 蛋白的下游设计了一段长约 700bp 的具有自主剪接功能的内含子核酶，以达到消除毒性的作用。以此策略构建全长感染性克隆质粒。测序结果显示，成功构建了 ZIKV GZ01 株的感染性克隆质粒，命名为 pACNR-ZIKV-Intron-IC。该质粒经 Xho I 酶切线性化后，通过体外转录制备 RNA，将 RNA 纯化并经 Splicing buffer 处理后，纯化得到具有感染性的 RNA。将 RNA 转染 BHK-21 细胞，培养 72 h 后将细胞冻融一次后，离心收集上清。将上清接种 C6/36 细胞，并在 28 ℃培养 6 天后收获病毒。从收获的病毒液提取 RNA，并进行 RT-PCR 检测，结果表明可扩增得到与预期大小一致的片段，并且在扩增的片段中存在我们引入的 Kpn I 位点标记，说明病毒拯救成功。
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2. 寨卡 GZ01 株恢复病毒的生物学性质鉴定
将亲本株病毒 GZ01 与恢复病毒 rGZ01 平行感染 BHK-21 细胞，对细胞内病毒蛋白的表达水平进行间接免疫荧光分析，实验结果表明亲本株 GZ01 与恢复病毒 rGZ01 在 BHK-21 细胞上具有相似的病毒蛋白表达特征；将亲本株病毒 GZ01与恢复病毒 rGZ01 平行感染 BHK-21、C6/36 以及 Vero 细胞，于不同时间收集感染上清并对上清中的病毒 RNA 进行实时定量 RT-PCR 分析，实验结果表明亲本株病毒 GZ01 与恢复病毒 rGZ01 在上述细胞中具有同样的生长特征；蚀斑形成试验表明二者具有一致的蚀斑形态。深度测序显示出 rGZ01 基因组序列与克隆序列一致，并且其单核苷酸位点变异特征与亲本株相似。乳鼠神经毒力试验显示恢复病毒毒力接近于亲本株，拯救株与亲本株感染 BALB/C 均出现明显的神经系统症状，包括后肢瘫痪、颤栗、活动迟缓等，且两种病毒感染导致乳鼠的死亡率也一致。上述结果表明我们获得的恢复病毒具有与其亲本株一致的生物学性质。因此，我们构建的 ZIKV 反向遗传学系统可为研究 ZIKV 编码蛋白功能以及分子致病机理等方面的可靠工具。
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第二章 ZIKV GZ01 5′-3′CS 生物学功能的初步研究 ........37
1. 实验材料 .........38
2. 实验方法 .........39
3. 实验结果 .........43
4. 总结与讨论 .....49
第二章 ZIKV GZ01 5′-3′CS 元件生物学功能的初步研究
登革热病毒（DENV）、西尼罗河病毒（WNV）、黄热病病毒（YFV）、日本脑炎病毒（JEV）和蜱传脑炎病毒（TBEV）等黄病毒病毒 RNA 复制需要各种RNA 顺式作用元件参与。研究表明，基因组 5′和 3′端的环化序列（cyclizationsequences ， CS ）结构是黄病毒复制所必需的。 CS 元件的核心序列（ 5′：UCAAUAUGCU，3′：AGCAUAUUGA）在蚊子传播的黄病毒[36]中是保守的。然而，ZIKV 的 CS 生物学功能尚未见相关研究报道。我们将 CS 元件的突变分别引入到 ZIKV 的复制子中（图 1）。将复制子 RNA转染到 BHK-21 细胞中，并在转染后 6，24，48 和 72 小时监测海肾萤光素酶报告基因活性。然后我们将相应的CS元件突变引入到pACNR-GZ01-Intron-IC中，通过5′CS元件（5′CS-M）的突变显示转染到 BHK-21 细胞中的病毒蛋白表达。相反，通过在 3′CS 元件（5′CS-M + 3′CS-M）中引入互补突变来恢复环化结构，重建 5′-3′CS相互作用，利用 IFA 显示相应突变体的病毒复制。本研究对感染性克隆中基因组5′和 3′端中 CS 元件进行突变和恢复突变，并进行衍生病毒的拯救和增殖能力的测定，最终确定这种环化序列（cyclization sequences，CS）结构对病毒粒子复制和增殖的影响。
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总 结
本研究构建了寨卡病毒广州 01 株全长感染性克隆，建立了其反向遗传学系统，并运用这种新型的反向遗传学系统对寨卡病毒复制元件进行了初步的生物学研究。本课题设计的新型寨卡病毒感染性克隆的构建策略，可以有效地解决黄病毒基因组对宿主细胞的毒性作用。本策略将具有自我剪接功能的 P.li.LSUI2 group II内含子核酶嵌入寨卡病毒 E 蛋白与 NS1 蛋白之间，阻止毒性蛋白在宿主细胞内表达，体外转录 RNA 进行自我剪接反应，得到具有感染性的寨卡病毒 RNA。这种新型的反向遗传学系统高效、稳定，为构建黄病毒感染性克隆的方法提供了全新的思路。成功拯救病毒，对其病毒学特征进行评价，并与亲本株进行比较，实验结果表明，其蚀斑大小，神经毒力均与亲本毒株较为接近，且在哺乳动物与蚊细胞中均可正常复制和表达特异的病毒蛋白。新型构建的寨卡病毒广州 01 株感染性克隆为寨卡病毒的基础研究提供了技术平台和研究手段。利用建立的新型反向遗传学系统，对寨卡病毒环化序列进行突变与恢复突变，以此研究寨卡病毒复制的相关元件。成功拯救了 5 ′CS 突变株和 5′-3′ CS 突变株，利用 IFA 法测定寨卡病毒结构蛋白的表达，实验结果表明，环化序列的互补与寨卡病毒复制有关。在含有 Rluc 基因的寨卡病毒深圳株复制子上进行了相应的突变，进行海肾荧光素酶活性的检测，实验结果得到了相同的验证。综上所诉，5′CS 和 3′CS 互补对寨卡病毒的复制具至关重要的影响。现在，寨卡病毒依然在全球范围内扩散，席卷全世界的寨卡危机还未解除，人类必将投入到与寨卡病毒的一次又一次的对抗中去。本课题建立的寨卡病毒反向遗传学系统将运用于寨卡病毒的研究、疫苗的研发以及抗寨卡病毒药物的筛选与评估等方面，是研究寨卡病毒，对抗寨卡病毒的强大武器。同时，我们认为这种新型的构建策略有潜力发展成为快速建立黄病毒反向遗传学系统的强大工具,造福于人类。
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参考文献（略）
