反义核酸技术及其在寄生虫学中的应用进展

反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术[1-3]。它包括反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes)三大技术。反义核酶作为一种基因下向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表达上发挥着重要作用。随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病的研究。本文拟就反义核酸技术的作用原理和特点作一简要概述，着重阐述其在寄生虫领域中的应用进展。 　　
1　反义核酸的作用原理 　　
反义核酸目前有三种来源：一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，这是反义核酸最普遍的应用方式，包括未修饰AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修饰AON二类，其中以PSAON应用最广泛。ANO设计合成简单，只要其顺序与靶mRNA部分顺序互补即可，而对基因的读码框无要求；二是更具有实用价值的工人表达载体，包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体[3]，它是利用基因重组技术将靶基因序列反向持插入到载体的启动子和终止子之间，通过转录可源源不断产生反义RNA分子；三是天然存在的反义核酸分子，但目前分离纯化尚存在困难。 　　
1.1　反义RNA和反义DNA 　　
反义RNA是指能和mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子。反义RNA和反义DNA主要是通过mRNA的翻译和基因DNA的转录而发挥作用[10]：1)抑制翻译。反义核酸一方面通过与靶mRNA结合形成空间位阻效应，阻止核糖体与mRNA结合，另一方面其与mRNA结合后激活内源性RNase或ribozyme，降解mRNA[3]；2)抑制转录。反义DNA与基因DNA双螺旋的调控区特异结合形成DNA三聚体(triplex),或与DNA编码区结合，终止正在转录的mRNA链延长[3]。此外，反义核酸还可抑制转录后mRNA的加工修饰，如5'端加帽、3'端加尾(poly a)、中间剪接和内部碱基甲基化等，并阻止成熟mRNA由细胞核向细胞浆内运输。 　　1.2　核酶 　　
Cech等发现四膜虫核糖体RNA前体在成熟过程中，可精确地自我切除某些片段并重新连接，这种具有酶催化活性的RNA称之为核酶[11,12]。 　　
核酶广泛存在于生物细胞中，有锤头状和发夹二种结构。酶活性中心由两个臂和中间的功能区组成[13]。两个臂序列高度保守，与靶RNA特异互补结合，相当于一种反义RNA，而功能区则可通过降解RNA的磷酸二酯键而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用过程中并不消耗。核酶裂解分子依赖严格的空间结构形成，裂解部位总是位于靶RNA分子中GUX三联体(X：C、U、A)下游方向即3'端[12]。 　　
核酶除天然存在外，也可人工合成。根据核酶的作用位点、靶mRNA周围的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工设计合成核酶的特异性序列。此外，利用基因工程将核酶的编码基因克隆在SP6或T7等启动子下游，通过转录合所需核酶。核酶能特异切割RNAA分子，使阻断基因表达，特别是阻断有害基因的表达成为可能。如果已知靶mRNA中GUX三联体的位置，可将核酶的编码基因插入反义表达载体的适当位置，这样转录所产生的含有核酶的反义RNA具有双重功能：一方面具有反义抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗肿瘤、抗病毒方面具有十分诱人的前景，第一个应用核酶进行艾滋病基因治疗的临床计划已获准，核酶作为一种遗传信息药物，在肿瘤基因治疗中必将日益受到重视。 　　
2　反义核酸的作用特点 　　
反义核酸作为基因治疗药物之一，与传统药物相比具有诸多优点。1)高度特异性：反义核酸药物通过特异的碱基互补配对作用于靶RNA或DNA，犹如“生物导弹”。2)高生物活性、丰富的信息量；反义核酸是一种携带特定遗传信息的信息体，碱基排列顺序可千变万化，不可穷尽。3)高效性：直接阻止疾病基因的转录和翻译。4)最优化的药物设计：反义核酸技术从本质上是应用基因的天然顺序信息，实际上是最合理的药物设计。5)低毒、安全：反义核酸尚未发现其有显著毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。 　　
3　反义核酸技术在寄生虫学中的应用 　　
反义核酸技术的飞速发展和成熟，使其逐渐渗透并应用到寄生虫学领域，丰富和发展了寄生虫病的基因治疗策略。反义核酸技术在抗寄生虫病研究的应用主要集中于原虫类，如疟原虫、锥虫和利什曼原虫等，而且反义核酸中又以AON方面的报道最多。下面着重就AON在寄生虫方面的研究应用作用一简要阐述。 　　
3.1　疟原虫 　　
疟原虫嘌呤核苷酸合成具有特殊性，即无从头合成途径，依靠补救合成途径利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷。疟原虫的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS)结合形成双功能蛋白(DHFR-TS)，这对于维持疟原虫四氢叶酸水平和DNA合成极为重要[14]，此酶也是疟原虫脱氧胸苷酸生物合成唯一通路中必不可少的酶。抗疟药中的抗叶酸代谢药如乙胺嘧啶，就是通过竞争性抑制DHFR-TS来阻断虫体脱氧胸苷酸生物合成[15]。然而，随着恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)多药抗性株的出现和广为传播，疟疾的化疗面临重大挑战，促使人们寻求新的抗疟疗法。目前，DHFR-TS是AON抗疟作用首选靶基因。 　　
生物大分子进入感染红细胞中的疟原虫，必需穿透三层膜，即红细胞膜、纳虫泡膜和虫体的胞质膜。研究表明，不能穿透红细胞膜和纳虫泡膜的大分子和葡聚糖、IgG2a抗体和蛋白A等，可经过纳虫微管(parasitophorous duct)进入虫体，虫体通过胞吞作用直接从细胞外摄入大分子物质[16]。因此，对于小分子的AON而言，作用于感染红细胞中的虫体完全成为可能，下述众多研究已充分证明了这一点。Rapaport等(1992)研究发现[17]，以DHFR-TS为靶21 nt PS AON能选择性地进入恶性疟原虫感染红细胞，对体外培养的氯喹敏感株和耐药株虫体具有同等的抑制效果，而未感染疟原虫的红细胞则完全为不摄入AON，因此这对应用反义核酸于抗疟治疗非常有利。 　　
诸多研究表明，AON越长，对转译的抑制作用就越强；AON浓度越高，非特异性抑制作用越明显，在低浓度时则呈特异性抑制。Sartorius和Franklin(1991)以DHFR-TS的mRNA为靶合成系列AON，利用兔网织红细胞翻译系统，探讨AON对体外转译的抑制作用[18]。在DHFR翻译起始位点处合成了6条21－49nt不等长的AON，在TS编码区全成的30nt、39nt和49nt三条AON。当AON长度为30nt或更长时，呈明显转译抑制作用，抑制率可高达50％以上。其中，TS编码区的49nt aON(OTS49)抑制效果最高，当浓度在45μmlo/L时的抑制率几乎达90％，主要是因为OTS49与DHFR-TS靶mRNA结合抑制TS合成，这从翻译产物的分子量(55 kDa)要比天然DHFR-TS(71 kDa)小且无TS活性可看出。 　　
Ramasamy等和Clark等研究表明，在较高浓度下，无论DHFR-TS正义还是反义的寡聚核苷酸(M1K，M2K)，均能抑制裂殖子入侵红细胞[19,20]。究其原因，可能与高浓度的AON带有较多的负电荷有关。Kanagaratnam等(1998)分析了疟原虫裂殖子表面蛋白基因的反义和正义寡聚核苷酸对疟原虫体外生长的影响[21]，无论AON单独使用抑或与脂质体混合使用，均未观察到特异抑制效应。但在相同浓度范围内，反义和正义寡核苷酸以及具有多聚阴离子的硫酸葡聚糖，均可抑制裂殖子入侵红细胞。当寡聚核苷与阳离子脂质体结合后负电荷被中和时，则对裂殖子入侵红细胞的抑制作用被取消。由此推测，寡聚核苷酸有可能借助其多聚阴离子特性干扰裂殖子与细胞上受体结合，多聚阴离子可能对疟疾病治疗有帮助。 3.1.2　AON不同修饰物对抗疟作用影响 　　
最近，Barker等以DHFR-TS基因为靶，比较了硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化修饰AON，以及不同空间结构AON对体外培养虫体生长抑制作用[22]。结果显示，5'和3'端至少含有3个PS基因的PO-PS杂合体AON、全部为PS修饰的AON，与部分PS修饰的AON抑制作用相同。在低浓度下(1μmol/L)，PO-PS aON和PS AON比PS-甲基化AON抑制率高25％。此外，通过延长AON序列增加干-环结构形成，提高AON的自我稳定性，结果获得2个有干-环结构的AON(RB39、RB41)，其抑虫生长率比序列未延长的AON约要高20％。 　　
3.1.3　AON不同靶基因对抗疟作用影响 　　
AON对不同基因的抑制作用不一致，这和该基因在虫体代谢过程中是否起举足轻重作用密切相关[14]。AON的抗疟研究主要集中在DHFR-TS基因，这固然与其在疟原虫核苷酸代谢中的特殊地位有关(见前述)。Barker等(1996)对恶性疟原虫耐药株多个靶基因的AON作用进行了比较研究[23]，方法是将PS aON加入到疟原虫体外培养液中，培养48小时后，通过镜检和3氚-次黄嘌呤掺入试验观察AON对虫体的生长抑制作用。结果表明，抑制作用与AON浓度密切相关。当AON浓度为1μmol/L时，AON呈非特异性抑制；当浓度在0.5－0.005μmol/L范围时，以DHFR-TS、二氢喋呤合成酶、核苷酸还原酶、裂殖体多基因家族和红细胞结合抗原-175为靶的PS aON与对照组相比，均能特异地显著抑制虫体生长(P＜0.0001)，而DNA聚合酶α的PS aON抑制作用更弱，磷酸丙糖异构酶的PS AON抑制作用则与对照组相同。 　　
疟原虫感染红细胞中，近75％血红蛋白被滋养体降解而形成大量对虫体有害的血红素，必须在消化泡中聚集成对虫体无毒的疟色素[24,25]。研究表明，恶性疟原虫组氨酸富集蛋白(HRP)家族中，HRPⅡ和HRPⅢ有明显的促进疟色素形成功能[26]。因此，如能特异阻断这些基因表达，抑制疟色素的形成，有可能使之成为一种抗疟新途径。HRPⅡ与HRPⅢ从同一祖先基因分化而来，二者高度同源，翻译起始位点附核苷酸序列则完全相同[27,28]。 　　
3.2　锥虫 　　
属于动基体目的布氏锥虫(Trypanosoma burcei)通过抗原不断变异逃避宿主的免疫力，抗原变异是由于不同的变异体专一表面糖蛋白(variant-specific surface glycoprotein，VSG)基因呈间断表达所致，VSG基因表达产物在锥虫表面形成外膜，覆盖虫体[29,30]。研究表明，VSG mRNA可分为二部分[31,32]：一部分是各种变异体特有的主外显子序列，占主要部分；另一部分是共同的5'端小外显子序列，通常为35个核苷酸长，几乎所有的VSG mRNA均含有此序列。实际上，除VSG外，锥虫的钙调蛋白、微管蛋白和磷酸丙糖异构酶mRNA中也存在共同的5'端小外显子序列，这似乎是动基体目寄生原虫编码基因的共同结构特征[32]。由于宿主mRNA无这种小外显子序列，以小外显子序列为靶的AON就很容易实现抑制众多基因表达的效果，使反义核酸抗锥虫感染成为可能。 　　
Cornelissen等应用麦胚提取物转译系统、35S-甲硫氨酸掺入试验和蛋白质SDS-PAGE方法[33]，对与锥虫小外显子序列不同位点互补和不同长度的AON体外转译抑制作用进行了比较分析。结果所有AON均能抑制转录，且抑制程度与AON长度和浓度有关，AON越长，浓度越高则抑制作用越强。如3个12nt和AON抑制率达35％－60％，而22nt和34nt aON在浓度为15－30μmol/L时对锥虫总RNA转录抑制率高达95％－100％。在同一转译系统中，BMV病毒(Brome mosaic Virus)和无小外显子序列的锥虫磷酸甘油酸激酶mRNA却完全不受34 nt AON的抑制，与锥虫小外显子序列不互补的18 nt AON对锥虫转译则无任何影响。上述发现充分证明，以锥虫5'端小外显子mRNA序列为靶的AON对转译具有特异抑制作用。 　　
Walder等用兔网织红细胞转译系统，也获得上述相类似的结果[31]。Verspieren等研究表明[34]，小外显子AON的二级结构和碱基的修饰会直接影响其与靶mRNA的亲和性，从而间接影响AON的转译抑制效果。如上述与小外显子第2位至第13位碱基互补的12nt aON，虽然抑制布氏锥虫转译，但不能抑制活动锥虫(Trypanosoma vivax)mRNA转译，这显然与二种虫体的小外显子第3位和第7位碱基不同有关。 　　
Verspieren等首次尝试用吖啶衍生物(acridine derivative)修饰布氏锥虫5'端小外显子序列的AON，观察其对培养虫体的杀伤作用[35]。结果表明，连接有吖啶分子的9nt aON与相同长度但未连接吖啶分子的AON相比，能更为有效地抑制锥虫蛋白质的体外合成，且能有效地杀死体外培养虫体。无论如何，未连接吖啶的9nt aON和虽连接吖啶但不与锥虫5'端小外显子序列互补的9nt AON，均不能杀死培养虫体。AON经吖啶修饰后能提高其杀锥虫作用，推测可能与下述因素有关：一是通过吖啶修饰增加AON与靶mRNA间的亲和力，二是提高对3'端核酸外切酶的抗性，延长其作用半衰期，三是促进AON对活细胞膜的穿透。因此，对AON进行吖啶修饰提高其作用效率值得研究借鉴。
3.3 利什曼原虫 　　
利什曼原虫(Leishmania)属动基体目寄生原虫，其所有mRNA的5´端也均含有一共同的由35个核苷酸组成的小外显子(5'-AC-CGCUAUAUAAGUAUCAGUUUCUGUACUUUAUUG-3')，这为AON提供了极好的作用靶位[37]。Ramazeilles等研究表明[38]，以小外显子为靶的16 nt PS AON(5'-CTGAT-GCTTATATAGC-3')能选择性地杀死培养鼠巨噬细胞中无鞭毛体，而对宿主巨噬细胞无损害。当16nt pS AON浓度为10μmol/L时，约30％感染巨噬细胞在培养后24小时好转。为进一步提高细胞对AON的摄入，将16nt pS AON与软脂酸连接，并与人的低密度脂蛋白(LDL)混合，用于体外感染巨噬细胞测试。结果表明，当浓度约为10μmol/L时，与LDL结合的16nt pS AON使41％±5％细胞治愈，而未结合LDL的16 nt PS AON只有25％±4％细胞治愈，推测LDL可能有利于细胞对AON的内吞作用。 　　
与上述结果相似，Chaudhuri等报道以5'端小外显子序列为靶的17nt pS AON(5'-CTGATACTTATATAGCG-3')同样能选择性地高效杀死培养鼠感染巨噬细胞中的无鞭毛体，须对巨噬细胞无任何损伤[38]。为促进宿主细胞对17nt pS AON的摄取，Chaudhuri很巧妙地利用受体介导技术将AON特异呈递到靶作用位点。由于哺乳动物巨噬细胞丰富的净化受体(scavenger receptor)[39,40]，这些受体能特异结合并降解经修饰的LDL，且与牛血清白蛋白(MBSA)人工配体有很高的亲和力，灾样为AON特异作用于巨噬细胞创造了条件[41]。首先是用MBSA覆盖已包裹17nt pS AON的脂质体，后者通过MBSA配体与巨噬细胞上净化受体特异结合，摄入巨噬细胞内后，随着脂质体的降解，AON即被释放出来。利用这种受体介导呈递技术，大大提高了AON作用效果。在17nt pS AON浓度为10μmol/L时，有MBSA和脂体包裹的AON能在5小时内杀死90％以上培养巨噬细胞的虫体，而未进行上述包裹的AON杀虫率只有20％。不难看出，这种由受体介导的内吞作用为反义RNA定向转运提供了可靠运载工具，它可将反义RNA定向、高效、低毒和安全地运送到靶细胞中充分发挥作用，避免了细胞外降解、非特异性摄入和安全性等问题，无疑是非常有前景的发展方向[41,42]。 　　
Hoerauf等成功地应用反义核酸技术分析环孢多肽A(cyclosporin a，CsA)与环孢多肽A结合蛋白(cyclophilin)二者在利什曼原虫感染中相互作用机制[43]。在此之前，CsA对利什曼原虫的作用是通过宿主细胞中cyclophilin还是虫体是的cyclophilin介导，始终未能明了。为此，Hoerauf首先从利什曼原虫分离纯化了2个分子量分另为20kDa和22kDa的cycolphilin，并进行了N'端测序。有趣的是，尽管它们的酶活性均受到CsA抑制，但用CsA预处理后的利什曼原虫对巨噬细胞感染率并未降低，由此看来CsA不能与利什曼原虫自身cyclophilin结合。为此，作者利用反义核酸技术和动物模型，首先合成针对鼠宿主巨噬细胞cyclophilin的AON，并在感染虫体前加入到巨噬细胞培养基中，结果巨噬细胞cyclophilin的表达和细胞内无鞭毛体的增殖均受到明显抑制，充分证明宿主细胞cyclophilin在虫体的细胞内增殖机制中发挥重要作用，首次阐明宿主细胞cyclophilin对细胞内利什曼原虫存活具有重要意义。 　　
3.4　其它原虫 　　
Ankri等利用反义RNA抑制溶组织内阿米巴(entamoeba histolytica)半胱氨酸蛋白酶基因表达[44]，结果筛选并获得一稳定转化虫株，其半胱氨酸蛋白酶活性90％被抑制。该转化虫株在Diamond培养基中生长速率正常，致细胞病变效应和溶组织活性与对照组转化虫株相同，但其吞噬作用则明显被抑制。 　　
4　展 望 　　
反义核酸在寄生虫学领域中应用还刚刚起步，不可避免地碰地许多有待解决的问题：1)目前的实验结果仅限于体外实验，多数处于体外培养水平，动物模型和体内的作用尚不得而知；2)现有研究多为AON，毕竟依赖人工合成，开展反义表达载体和ribozyme于抗寄生虫研究甚为必要；3)定向打靶问题。反义核酸如能专一地定向进入靶细胞发挥作用，必将提高其作用效果，开展诸如受体介导的定向转移技术研究势在必行。总之，由于反义核酯具有许多其它药物不可比拟的特性，它在寄生虫学中的应用前景不可估量，特别是对于提示寄生虫学中某些长期悬而未决的机制具有很大潜力。随着研究的不断深入，当人们成功地驾驭这种技术时，必将造福广大人类。
参考文献 　　
略