蓖麻毒素毒性作用机理研究进展

蓖麻毒素作为免疫毒素中最常应用的毒素之一伴随着肿瘤导向治疗的研究受到了国内外的重视，对其毒性作用的认识也不断深化。以往认为蓖麻毒素仅是单一的蛋白质合成抑制剂，近几年研究发现，除此之外它还具有诱导产生细胞因子，引起脂质过氧化及诱导细胞凋亡的作用。 　　
一、蓖麻毒素的结构特点 　　
蓖麻毒素是从蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64 000。毒素由A和B两条多肽链组成，两链间由一个二硫键连接。目前，A链和B链的氨基酸序列以及二级结构已基本清楚。毒素B链上含有两个半乳糖或半乳糖残基结合位点，可和细胞表面的含半乳糖残基的受体结合，通过内陷作用进入细胞质，发挥毒性作用。蓖麻毒素A、B链上还分别含有1和2个糖支链，链末端均为甘露糖残基［1］，可以和网状内皮细胞特别是巨噬细胞结合。后者细胞表面富含甘露糖受体，可优先摄取蓖麻毒素，这对于毒素发挥生物功能有重要的作用。 　　
二、蓖麻毒素毒性作用机理 　　
1.抑制蛋白质合成：蓖麻毒素具有强烈的细胞毒性，属于蛋白合成抑制剂或核糖体失活剂，这也是在构建免疫毒素时，应用到蓖麻毒素的主要原因。毒素抑制蛋白合成的机理在70年代已经明确，以后略有补充［2，3］。首先，毒素依靠B链上的半乳糖结合位点与细胞表面含末端半乳糖残基的受体结合，促进整个毒素分子以内陷方式进入细胞，形成细胞内囊，毒素从细胞内囊中进入细胞质，随后蛋白链间二硫键被还原裂解，游离出A链。A链是一种蛋白酶，作用于真核细胞核糖体60S大亚单位的28S rRNA，水解A4324位点的腺嘌呤N-糖甙甙键，使其脱去腺嘌呤，丧失抗RNA酶的抗性而被降解，不能与延长因子(EF-2)结合，从而干扰了核糖体，EF-2，鸟嘌呤三磷酸腺苷(GTP)复合体的形成，导致蛋白质合成的抑制，最终细胞死亡。已引起研究者注意的是：① B链对A链发挥毒性具有重要的促进作用。② 在细胞内链间二硫键的还原裂解对毒素发挥毒性作用具有重要作用。③ 最新的研究表明：B链上的半乳糖结合位点也参与了毒素的体内毒性［4］。 　　
2.诱导细胞因子的损伤作用：蓖麻毒素中毒损伤的许多症状，不能完全由抑制蛋白质合成来解释，促使学者探讨其新的毒性作用机理。1986年，Tracey等［5］发现蓖麻毒素中毒大鼠的肠道损伤类似TNF/Chchectin处理的大鼠肠道。1991年Nadkami和Deshphude认为蓖麻毒素中毒后的许多现象，例如：发热，肝出血性坏死，腹水，胸水的渗出，肠道的出血坏死性炎症等等早期的急性反应都与肿瘤坏死因子(TNF-α)，白细胞介素(IL-1)，IL-6的分泌有关。1993年，Licastro等［6］检测到蓖麻毒素诱导体外培养的外周血单核细胞分泌TNF-α和IL-1β，同时在蓖麻毒素中毒大鼠的血浆中亦可检测到低水平的TNF-α。1994年Mudlooon等［7］发现，体内注射抗TNF的抗体，将明显降低蓖麻毒素对小鼠的氧化损伤。1997年，董巨莹等［8］亦报道了TNF在蓖麻毒素中毒小鼠肝脏的免疫组织化学定位。细胞因子参与机体损伤的另一个例子是：对于由蓖麻毒素构建的免疫毒素1，2期临床试验中病人出现的副作用：包括发热、肌痛、毛细血管渗漏综合症等可以通过封闭或拮抗这些细胞因子的功能而减轻［6］。 　　
蓖麻毒素诱导细胞因子的机理目前多数认为是通过刺激淋巴样细胞产生的。主要为巨噬细胞和肝Kupffer′s细胞。这些细胞表面含有甘露糖受体，可与蓖麻毒素分子中3个末端甘露糖残基特异结合而优先被摄取。蓖麻毒素诱导细胞因子的分泌有剂量和时 间依赖性。毒素是否可诱导其他细胞因子的产生以及各细胞因子之间是否具有网络免疫调节的作用，尚待探讨。 　　
3.脂质过氧化损伤作用：蓖麻毒素与巨噬细胞的相互作用，不仅诱导细胞免疫，而且诱导产生自由基和活性氧，引起脂质过氧化作用。1991年，Muldoon和Stohes［9］发现蓖麻毒素可以诱导小鼠体内的脂质过氧化作用，结果导致尿液中丙二醛、甲醛、丙酮的含量增加。1992年的研究表明［10］，各脏器中脂质过氧化强度(MDA含量)，还原型谷胱甘肽的减少以及DNA单链断裂程度在毒素中毒36小时后最为强烈，且肝脏的损伤最为严重。结合以往的研究［11］：谷胱甘肽的使用可以部分对抗致死剂量的毒素效应，具有潜在的化学保护作用，因此，Muldoon等［10］认为蓖麻毒素引起的氧化作用可 以归属到蓖麻毒素的毒性机理中去。 　　
许多毒物可以通过激活巨噬细胞分泌ROS(reactive oxygen species)和TNF诱发氧化作用。已有的研究表明［7，12］：TNF-α抗体，铁离子对蓖麻毒素诱导的脂质过氧化和氧化损伤起重要的调节作用。给小鼠注射抗TNF-α的抗体，可以明显降低尿液丙二醛，甲醛，丙酮的含量。铁离子以及去铁敏(desferrioxamine)的掺入，可分别增加和减少蓖麻毒素诱导的脂质过氧化的水平。蓖麻毒素引起体内氧化损伤的机理还待更深入的探讨。 　　
4.蓖麻毒素诱导细胞凋亡：坏死和凋亡是细胞死亡的两种方式。在引起细胞凋亡的三大类因素中，毒素，抗癌药物是其中之一。以往认为化疗药物是通过引起靶细胞发生不可逆代谢障碍而杀死肿瘤细胞，近年来认为是通过改变生理环境而诱发细胞发生PCD(programmed cell death)而达到疗效。1989年，Leek等［13］报道：在蓖麻毒素中毒的肠道病理研究中利用免疫组织化学和电子显微镜观察到肠道上皮细胞的胞浆中存在凋亡样的变化。1990年，Waring报道［14］；蓖麻毒素可诱导巨噬细胞，未成熟T细胞出现DNA破碎(DNA fragmentation)，而后者被认为是与凋亡有关的生化改变之一。1991年，他们报道了蓖麻毒素诱导上皮样细胞发生凋亡样的形态学改变。1996年，Fu等［4］报道了蓖麻毒素可诱导小鼠体内甲状腺，脾脏的细胞出现凋亡现象。 　　
凋亡的发生与一些凋亡相关基因的开放和凋亡蛋白表达的调节有关。蓖麻毒素作为蛋白合成抑制剂又如何诱导细胞发生凋亡呢?两者是否矛盾呢?已有的实验证实［14］：蓖麻毒素等蛋白质合成抑制剂诱导细胞凋亡的机制与它们抑制蛋白合成作用无关，亦不需要Ca2 依赖性核酸内切酶的参与，而是与其升高细胞内的三磷酸肌醇水平有关。另外，有报道［15］：巨噬细胞的粘附可以阻止蓖麻毒素诱导的巨噬细胞凋亡现象的发生。蓖麻毒素的抗吞噬细胞作用可能直接导致DNA断裂和诱导细胞凋亡。资料表明：引起细胞坏死的有害因素在强度很大时可导致细胞坏死，但强度较小时却引起细胞发生凋亡［16］。蓖麻毒素诱导的细胞凋亡也存在明显的剂量依赖性［15］。总之，蓖麻毒素诱导细胞发生凋亡与传统的蓖麻毒素作为蛋白质合成抑制剂并不构成矛盾，有可能对现有的凋亡理论是一种非常关键的补充和完善。
三、总结和展望 　　
蓖麻毒素的毒性具有明显的剂量依赖性，毒素诱导细胞因子的产生，引起体内脂质过氧化损伤以及诱导靶细胞凋亡等等都是在小剂量范围内具有的，而大剂量的蓖麻毒素仍主要表现为抑制蛋白质合成的毒性。毒素诱导细胞因子的产生及引起体内脂质过氧化损伤的作用，均与其糖链末端甘露糖残基被巨噬细胞特异性摄取，并激活巨噬细胞有关，是毒素损伤的继发作用。蓖麻毒素等蛋白质合成抑制剂诱导凋亡的理论研究对现有的凋亡理论可能会有重要的补充价值。 　　
蓖麻毒素的毒性作用机理研究，特别是近几年的研究进展，丰富了人们对蓖麻毒素毒性作用的认识，为蓖麻毒素抗癌研究进一步提供了理论依据和新的思路。 　　
本课题受国家自然科学基金资助(编号：39500122) 　　作者单位：710032 西安市 第四军医大学毒理学教研室
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