1绪论
1.1组织工程概述
20世纪80年代，美国华裔科学家冯元侦教授首次提出“组织工程学”(tissueengineering，TE)这一概念。随后美国麻省理工学院化学系Langer教授和医学院的临床医生Vacanti教授正式提出组织工程的概念[11。.1987年，美国国家科学院基金会（NSF)正式采用这一术语，并明确了组织工程的定义：“应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究幵发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。“组织工程的基本原理是将体外培养扩增的正常组织细胞黏附于一种具有优良细胞相容性并可被机体降解吸收的生物材料上形成复合物，然后将细胞一生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的并且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的（见图1.1)。组织工程是一个涉及细胞生物学、材料科学、生物力学、反应器工程和临床医学等多个学科交叉的研究领域。全球每年约有超过一千多万人罹患角膜盲症⑴。根据2001年世界卫生组织发布的研究报告，指出角膜疾病已经成为仅次于白内障的第二大致盲疾病。2008年第二次全国残疾人抽样调查统计，我国当时共有视力残疾约1691万人，其中角膜病致盲患者约400万人。而大部分角膜疾病又是由于角膜上皮结构和功能异常而引起的，例如化学烧伤、Stevens ohnson综合症和角膜接触镜引起的角膜疾病。这些疾病会导致角膜缘干细胞缺乏（limbal stem cell deficiency，LSCD),会引起结膜上皮迁移穿过角膜缘，使角膜变的不透明，从而失去视觉，同时使角膜产生新生血管、炎症反应及严重的不适。目前，临床上治疗这类角膜疾病最有效的方法是异体角膜上皮移植，然而，存在角膜供体来源严重不足、术后免疫排斥反应强烈和各种并发症等问题，致使大多数角膜疾病患者无法通过及时的角膜上皮移植而重获光明。随着组织工程技术的发展和进步，组织工程化角膜上皮将为角膜疾病开辟新的治疗方法。目前，利用组织工程技术体外构建组织工程角膜上皮在角膜上皮组织的修复方面已取得了显著成就，并在临床治疗实践中获得了满意的疗效利用组织工程技术体外构建角膜上皮的主要方法是在合适的支架材料上培养种子细胞，通过气一液相培养的方法诱导种子细胞分化为多层角膜上皮。因此，种子细胞的来源以及支架材料的选择是现阶段组织工程角膜上皮需要解决的两大关键问题。
1.2组织工程角膜上皮相关种子细胞的研究进展
组织工程角膜上皮的种子细胞来源要求种子细胞容易分离获取，在细胞的取材过程中尽量减少对自体健康组织造成损伤，在体外培养及重建过程中具有较高的增殖能力，能长期维持其生理功能及生物活性目前可应用于组织工程化角膜上皮的种子细胞主要有角膜缘干细胞（Limbal stem cells，LSCs)、口腔粘膜上皮细胞（oral mucosal epithelial cells , OMECs )、结膜上皮细胞(conjunctival epithelial cells, CECs)、羊膜上皮细胞(human amnioticepithelial cells, HAECs)、表皮干细胞（epidermal stem cell, ESCs)、脂肪源间质细胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs)、骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymal stem cells, BMSCs)、毛囊干细胞（hair follicle stemcells, HFSCs)、胚胎干细袍(Embryonic stem cells, ESCs)和诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)等。
1.2.1角膜缘干细胞
角膜缘干细胞是一种成体干细胞，同时也是一种单能干细胞，是正常角膜上皮增殖和分化的来源。多数研究者认为，角膜缘干细胞位于基底层边缘（图1.2)上皮的过渡区位于角膜和球结膜之间即在角膜缘基底部形成的特殊“Vogt栅栏”内，但此处的基底细胞只有少量干细胞，其余大部分是短暂扩充细胞(transient amplifying cell, TAC)。其主要作用是修复和保持角膜表面的完整。角膜缘干细胞具有以下特点_ (1)角膜缘干细胞位于角膜缘基底部，占整个角膜上皮细胞量的0.5?10%; (2)有水平向心运动和垂直向上运动两种运动形式；(3)细胞的增殖能力强，周期长，分化程度低，且不对称分裂；（4)不表达角膜上皮细胞的特异性标志蛋白角蛋白3; (5)含有丰富的蛋白酶（如a-稀醇酶、细胞色素氧化酶、碳酸酌酶等）；（6)角膜缘上皮细胞在」下常情况下处于G1晚期，细胞中含有大量的周期蛋白A、D、E和增殖细胞核心抗原。
2丝素蛋白/P(LLA-CL)共混纳米纤维制备与表征
2. 1引言
目前，常用的组织工程角膜上皮支架材料主要有：合成高分子材料，如聚乙酷（PGA)、聚乳酸（PLLA)及两者的共聚物等；天然高分子材料，如羊膜、胶原、丝素蛋白等。前者的亲水性及生物相容性较差，而后者在支架的制备过程中可控性较差，易出现性能和结构的变化，力学性能较差。而由天然高分子材料和合成高分子材料组成的复合支架材料可以集中这两种支架材料的各自优点，克服各自的缺点。丝素蛋白（SF)是香丝的主要成分，具有良好的生物相容性，在体内可以被蛋白酶完全降解有研究报道，角膜上皮细胞能够在丝素蛋白支架上生长增殖但单纯丝素蛋白膜，比较脆且易碎，力学性能欠佳，临床上缝合时易撕裂，不能满足移植手术的缝合要求。聚乳酸-聚己内酷（P(LLA-CL))是乳酸和e-己内酷的共聚物，具有良好的生物相容性、生物可降解以及良好的力学性能，但其因疏水性较强，不利于细胞的黏附和增殖，进而限制了其应用。本研究拟利用天然材料-丝素蛋白（SF)混合人工合成高分子材料-P(LLA-CL)，通过静电纺丝技术制作出良好生物相容性、具有较好三维结构、有一定力学性能和有利于角膜上皮细胞點附增殖的组织工程角膜上皮支架材料。
3利用丝素蛋白/P(LLA-CL)纳米纤维膜........ 21
3.1引言 ........21
3.2实验部分........ 22
3.3结果与讨论 ........26
93.3.1兔角膜缘上皮细胞的培养........ 29
3.4 小结........ 36
4丝素蛋白/P(LLA-CL)纳米纤维膜体内生物相容性研究........ 38
4.1引言........ 38
4.2 实验部分........ 38
4.3结果与讨论 ........42
4.3.1术后裂隙灯显微镜大体观察........42
4.3.2 HE染色分析 ........42
4.4小结 ........ 44
5 结论与展望........ 45
5.1本论文主要结论........ 45
5.2存在问题与展望........ 46
结论
本实验主要研究了兔角膜缘上皮细胞在丝素蛋白（SF)和乳酸-己内酯共聚物（P(LLA-CL))复合纳米纤维（SF/P(LLA-CL))薄膜上的黏附、增殖和分化情况，探讨SF/P(LLA-CL)复合纳米纤维薄膜作为组织工程角膜上皮支架材料的可行性。在材料方面，研究比较了用水蒸汽后处理和用乙醇蒸汽后处理对SF/P(LLA-CL纳米纤维支架材料物化性质的影响。同时研究比较了兔角膜缘上皮细胞在两种材料上的黏附与增殖情况。还研究了 SF/P(LLA-CL)支架材料在角膜基质内的生物相容性。通过扫描电镜、接触角分析和透明度测试，研究比较了用水蒸汽后处理和用乙醇蒸汽后处理对SF/P(LLA-CL纳米纤维支架材料物化性质的影响，。结果显示：通过SEM发现未处理组的丝素蛋白/P(LLA-CL)纳米纤维的纤维直径值最大，用75%乙醇蒸汽后处理的丝素蛋白/P(LLA-CL)纳米纤维的纤维直径值最小。通过接触角分析，发现乙醇处理组的接触角最大，水蒸气处理组与未处理组、丝素蛋白/P(LLA-CL)纳米纤维膜的接触角相似。在目测情况下，所有处理组的丝素蛋白/P(LLA-CL)纳米纤维膜湿态都比干态更透明。通过酶标仪分析，发现所有处理组的丝素蛋白/P(LLA-CL)纳米纤维膜湿态时的透光率都比干态时高。一将原代兔角膜缘上皮细胞种植于SF/P(LLA-CL)纳米纤维薄膜上进行复合培养。细胞黏附实验和MTT分析发现经水蒸气处理的SF/P(LLA-CL)纳米纤维膜更能促进角膜缘上皮细胞的增殖；细胞活力检测显示细胞在材料上生长良好，未见明显的死细胞，部分区域细胞呈2?层生长；免疫荧光染色表明生长在材料上的兔角膜缘上皮细胞，既有成熟的角膜上皮细胞，还含有角膜上皮干细胞。HE染色发现兔角膜缘上皮细胞在材料可以连续成片生长；扫描电镜显示角膜缘上皮细胞在材料上保持正常上皮细胞的铺路石样形态，黏附生长良好，细胞表面布满微绒毛，细胞间紧密联接。
参考文献
[1] Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science. 1993; 260(5110): 920-6.
[2] Whitcher JP, Srinivasan M, Upadhyay MP. Corneal blindness: a global perspective. Bull WorldHealth Organ. 2001; 79(3): 214-21.
[3] Gomes JA, Geraldes Monteiro B, Melo GB, Smith RL, Cavenaghi Pereira da Silva M, Lizier NF, et al.Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of human immature dental pulpstem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010; 51(3): 1408-14.
[4] Koizumi N, Inatomi T, Suzuki X Sotozono C, Kinoshita S. Cultivated corneal epithelial stem celltransplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 2001; 108(9): 1569-74.#p#分页标题#e#
[5] Nishida K, Yamato M, Hayashida Y, Watanabe /shdxbylunwen/ K; Yamamoto K, Adachi E, et al. Cornealreconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. NEngl J Med. 2004; 351(12): 1187-96.
[6] Sahu SK, Govindswamy P, Sangwan VS； Thomas R. Midterm results on ocular surfacereconstruction using cultivated autologous oral mucosal epithelial transplantation. Am J Ophthalmol.2007; 143(1): 189; author reply -90.
[7] Schneider Al, Maier-Reif K, Graeve T. Constructing an in vitro cornea from cultures of the threespecific corneal cell types. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999; 35(9): 515-26.
[8] Ebato B, Friend J, Thoft RA. Comparison of central and peripheral human corneal epithelium intissue culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1987; 28(9): 1450-6.
[9] O'Callaghan AR, Daniels JT. Concise review: limbai epithelial stem cell therapy: controversies andchallenges. Stem Cells. 2011; 29(12): 1923-32.
[10] Pellegrini G, Traverso CE, Franzi AT, Zingirian M, Cancedda R, De Luca M. Long-term restoration ofdamaged cornea surfaces with autologous cultivated corneal epithelium. Lancet. 1997; 349(9057):990-3.
