1 前言
多能性干细胞具有自我更新和分化为体内各类型细胞的能力，因此多能性干细胞在未来的细胞治疗中会起着举足轻重的作用。追述多能性干细胞研究的历史是从胚癌细胞细胞开始的，它也展现一定的增殖能力和分化能力，但毕竟核型不正常，尤其当胚胎干细胞被建立之后，大家还是更加关注多能性干细胞的研究[3]，可以概括为以下几个方面：多能性干细胞自我维持机制的研究，获得方式的研究，不同物种的比对和临床级别多能性干细胞的建立。这些方面都是相互影响，相辅相成，科研的最终目的是为人类谋福祉，而对多能性干细胞的研究也是如此，只有对多能性有深入了解才能建立完善的培养体系，才能创造出更安全的多能性细胞产生方式，才能完成物种间的对比，为人多能性干细胞的临床应用作铺垫。以下就将针对这几个方面的研究做综述。
1.1 细胞的定型( 建议改为“细胞的命运决定与分化”)
受精是一个个体发育的开始，在大家普遍认为八细胞之前胚胎的每个卵裂球都是全能性的，每个卵裂球都可以完整支持胚胎的发育。通常认为在桑椹胚晚期的时候细胞已经开始定型。3.5 天之后的内细胞团也会呈现两种细胞类型：原始外胚层（primitive ectoderm）和原始内胚层（primitive endoderm）细胞。原始内胚层细胞最终参与胚外组织（extraderm）的发育，原始外胚层可以进一步发育为上胚层（epiblast），支持个体的发育。伴随这样一个细胞定型的过程，很有可能有些细胞在转化的过程中一直保持着多能性的状态，甚至是全能性的状态。限于目前技术手段等限制，很难将这种细胞分离出来并证明其多能性的状态。而目前所能做的是对一类细胞进行功能验证，检测或者是对一类细胞群体进行分离。通过前后两个阶段的对比，很容易确定两个细胞群体有否区别，并能够给出一些证据。但是这些数据的出现只是一些高通量，或者认为有理论根据的数据，并且这些数据也是一种相对定量的统计结果，无法给出绝对的定义。这个是最令所有人迷惑的地方，怎样将所占很小比例的细胞的比重进行合理放大，这才是目前应该研究的一个命题。想要对这个问题进行完整的解答还是要回到植入前胚胎的发育，再到植入后胚胎的发育过程中来。多能性是在胚胎发育到一定阶段，一般是上胚层时期，通过体外分离培养使之维持增殖并具有分化能力的状态。建立多能性干细胞的方式很多，但总的来说有两种：胚胎来源和体细胞来源。胚胎来源的多能性干细胞被称为胚胎干细胞。由于胚胎干细胞和胚胎生殖细胞类似，这说明胚胎干细胞和胚胎生殖细胞有共同的起源。或者胚胎干细胞来源其前体或本身的转化。目前很难对这个问题进行解答。首先不知道对每个的细胞的界定标准是什么，因为根据目前的研究结果来看，无论是胚胎干细胞还是上胚层干细胞，它们的均质性非常差，至少是分群的。这就很难去寻找两种不同的细胞类型起源（如图 1-1 示）。
1.2 小鼠胚胎干细胞的研究进展
第一株小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，mouse ESCs）是在 1981 年从体外培养的囊胚建立的[7, 8]，具有三胚层的分化能力。胚胎干细胞的出现代替了畸胎瘤胚胎细胞的研究，使人们对畸胎瘤胚胎细胞的研究不再那么关注，胚胎干细胞的出现改变了现有的对多能性干细胞的理解，多能性干细胞在没有核型异常的情况下依然存在[3, 9]。之后小鼠胚胎干细胞的多能性被进一步验证，不仅具有自我更新和分化能力，也可以通过嵌合体实验进行生殖系的传递，黄金标准是通过四倍体补偿实验可以得到存活的动物[10]。在小鼠胚胎干细胞出现之后，人们进一步发现了多能性干细胞的自我更新机制，白血病抑制因子（LeukemiaInhibitory Factor，LIF）在维持多能性细胞的生长和自我更新，这种因子的发现是在通过饲养层培养小鼠胚胎干细胞时发现的[11, 12]。它属于白细胞介素 6（IL-6）的家族成员。LIF 因子可以结合细胞膜表面的受体 LIF 受体（LIFRβ）和 gp130。二聚体 LIFRβ-gp130 又可进一步作用下游通路的 STAT3，可以磷酸化 c-MYC 蛋白 58 位的苏氨酸，从而进一步调控多能性基因的表达[10, 13]。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物和材料
C57BL/6，是一近交系背景的小鼠重症联合免疫缺陷小鼠 (Severe Combined Immunodeficiency Mice； SCID mice)上述动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司东北民猪，哈尔滨三元公司杜洛克猪，北京昌平大动物实验基地胎儿包皮，北京儿童研究所
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.1.1 小鼠胎儿成纤维细胞的分离和培养
取 13.5 天的孕鼠，断颈法处死后，取出子宫，置于盛有 PBS 的皿中，将子宫一侧提起剪断，另一侧也提出时剪开，从鼠体分离开来。剥掉子宫膜和羊膜取出胚胎，置于 PBS 的另一个皿中。去头、四肢、尾和肝脏。用 PBS 洗两次之后充分剪碎，再加 PBS 洗一次，并将组织碎块和 PBS 一起转移至一个小的培养皿中，倾斜静止，待组织块下沉后，吸出 PBS。加入 3ml PBS，2ml 0.05%的胰酶/EDTA，吹打消化 2-3 分钟。加入 5ml 成纤维细胞培养液终止胰酶消化。900rpm, 10min，弃上清，加入 2-3ml 成纤维细胞培养液，重悬细胞沉淀。补充培养液， 于 10cm 的细胞培养皿中培养，第二天换液培养。获得的原代胚胎成纤维细胞记为P0代。再传代为 P1,2….，在成纤维细胞培养液中培养，可在 4-5 代内作为饲养层细胞使用，使用丝裂霉素处理或经射线照射后方可作为饲养层细胞（feeder cell）。
3 结果与分析 ....26
3.1 通过培养体系的优化将人 ES 细胞转化.....26
3.2 快速诱导具有小鼠 ES 细胞样猪 iPS 细胞 .......32
3.3 临床级别人孤雌 ES 细胞建系....40
3.3.1 临床级别饲养层的准备.......40
3.3.2 临床级别干细胞系的建立.........41
3.3.3 多能性及生物安全性检测.........43
4 讨论 ..........47
4.1 环境决定细胞的命运 .....47
4.1.1 人的多能性状态的转换.......47
4.1.2 猪 iPS 细胞的诱导及应用 .........48
4.2 多能性干细胞的未来 .....48
5 结论 ..........50
结论
本研究主要通过改变培养体系和外源因子导入的方法尝试获得小鼠 ES 细胞样的其他物种的多能性干细胞，并对所得干细胞的多能性进行了深入分析和应用检验，主要结论如下：
（1） 通过基础培养液的改变（LBX 培养液）和小分子（SU5402，PD025901，CHIR99021，Forskolin，VC 和 SB431542）的添加，可以将人 ES 细胞（H9和 P-TJ）转变成小鼠 ES 样细胞。
（2） 通过培养体系的改善可以提高猪 iPS 细胞的诱导效率，并得到两种不同状态的猪 iPS 细胞：pips_h 和 pips_m 细胞，两种细胞在多种细胞生物学特征上具有显著的区别。
（3） 从人的孤雌胚胎可以成功建立临床级别的胚胎干细胞系，并通过多能性的和生物安全性的各种检测。
参 考 文 献
[1] M.A. Esteban, J. Xu, J. Yang, M. Peng, D. Qin, W. Li, Z. Jiang, J. Chen, K. Deng,M. Zhong, J. Cai, L. Lai, D. Pei, Generation of induced pluripotent stem cell lines fromtibetan miniature pig, J Biol Chem, (2009).
[2] T. Ezashi, B.P. Telugu, A.P. Alexenko, S. Sachdev, S. Sinha, R.M. Roberts, Derivationof induced pluripotent stem cells from pig somatic cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 106(2009) 10993-10998.
[3] D. Solter, From teratocarcinomas to embryonic stem cells and beyond: a history ofembryonic stem cell research, Nat Rev Genet, 7 (2006) 319-327.
[4] T.P. Zwaka, J.A. Thomson, A germ cell origin of embryonic stem cells?, Development,132 (2005) 227-233.
[5] K. Hayashi, S.M. Lopes, F. Tang, M.A. Surani, Dynamic equilibrium and heterogeneityof mouse pluripotent stem cells with distinct functional and epigenetic states, CellStem Cell, 3 (2008) 391-401.
[6] J. Nichols, A. Smith, The origin and identity of embryonic stem cells, Development,138 (2011) 3-8.
[7] M.J. Evans, M.H. Kaufman, Establishment in culture of pluripotential cells from mouseembryos, Nature, 292 (1981) 154-156.
[8] G.R. Martin, Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos culturedin medium conditioned by teratocarcinoma stem cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 78 (1981)7634-7638.
[9] G.R. Martin, Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis, Science, 209 (1980)768-776.
[10] R. Jaenisch, R. Young, Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency andnuclear reprogramming, Cell, 132 (2008) 567-582.
