农学论文哪里有？本研究所选均为纯种蒙古羊和乌珠穆沁羊，不存在基因污染。首次通过直接测序与MassARRAY技术分析发现，蒙古羊和乌珠穆沁羊LEPR基因存在同义突变c.189T>A、c.240C>T、c.279C>T、c.1683G>A和c.2373T>C；以及错义突变I28V、R62H、H182Q和T248I。
第一章 文献综述 LEPR基因与绵羊高繁殖力的研究进展
1.2国外绵羊繁殖力相关研究进展
据不完全统计，繁殖率达到200%及以上的绵羊品种已有10余种[3]，如繁殖率250%的德国东佛里生羊（East Friesian sheep），繁殖率200%的英国边区莱斯特羊（Border Leicester sheep），繁殖率270%的芬兰兰德瑞斯羊（Finnish Landrace sheep）和繁殖率220%的澳大利亚布鲁拉美利奴羊（Booroola Merino sheep）等。其中世界著名品种布鲁拉美利奴羊中的优秀种群繁殖率可高达350%；纯合的布鲁拉美利奴羊平均产羔数可高达2.9只[8]。研究人员最早在布鲁拉美利奴绵羊上发现FecB 基因，该基因现已经是目前研究最多的控制绵羊排卵率和繁殖性状的主效基因。在2001年Mulsant、Wilson和Souza等发现BMPR1B基因编码序列的突变与布鲁拉美利奴绵羊的FecBB基因突变完全相关，并且来自突变型纯合FecB B / FecB B的母羊卵巢细胞对BMPR1B受体的配体反应低于来自野生型纯合FecB ＋ / FecB ＋的母羊卵巢细胞[14,15,16]。
罗曼诺夫羊（Romanov sheep）原产于莫斯科西北部，该品种以产羔率高而著名，单胎最高产羔纪录为9只。并且该品种发情期早，3月龄时母羔体重达到20 kg即可妊娠，公羔在3到5月龄可配种[3]。罗曼诺夫羊常作为杂交的父系品种，法国以罗曼诺夫羊和别里雪昂羊（Berrichon sheep）杂交，杂交母羊的平均产羔数较纯种母羊来说提高了65%；西班牙以罗曼诺夫羊与阿拉贡羊（Aragonesa sheep）杂交，杂种羊在5月龄时达到性成熟占比72.4%，而纯种羊仅占30.5%[17]。并且以罗曼诺夫为父系杂交的杂种羊，其高繁殖力的特点能保持到第二代，就算只拥有四分之一罗曼诺夫血统的三代杂种羊，也能保持平均产羔数在1.6只的水平，而没有进行杂交的纯种羊平均产羔数为1.24只[18,19]。
3、结果
3.1 LEPR基因与两种羊多胎性状关联性分析
3.1.1挖掘LEPR基因各突变位点信息
本实验利用直接测序法在250只蒙古羊群体与121只乌珠穆沁羊群体的LEPR基因上发现共10个突变位点，其中包括1个已知位点和9个新发现的位点。其中c.82A>G、c.185G>A (R62H)、c.189T>A、c.240C>T和c.279C>T位于4号外显子，c.546C>T位于6号外显子，c.743C>T位于7号外显子，c.1683G>A位于12号外显子，c.2373T>C位于16号外显子，g.43179091G>A位于12号内含子。在蒙古羊和乌珠穆沁羊实验群体中，除已知位点R62H之外，未检测到LEPR基因中rs428867159和rs405459906已知突变信息。各突变位点位置信息如图3.1所示。各突变位点基因型测序峰图如图3.2所示。
4、讨论
4.1 LEPR基因各突变位点多态性
本研究在蒙古羊及乌珠穆沁羊的LEPR基因中共发现10个SNP，其中包括1个已知突变（rs411478947 (c.185G>A, R62H)）以及9个新突变（c.82A>G、c.189T>A、c.240C>T、c.279C>T、c.546C>T、c.743C>T、g.43179091G>A、c.1683G>A和c.2373T>C）。随后通过LD分析各SNP位点的连锁效应，发现共有两组位点相互连锁，分别为：c.240C>T和c.279C>T（LD1）和g.43179091G>A和c.1683G>A（LD2）；其中LD1为完全连锁不平衡现象。同时对各SNP进行群体遗传多样性分析发现，两种羊LD1的优势等位基因为T；LD2的优势等位基因为A，由此我们推断LD1和LD2突变型等位基因可能对绵羊产羔数起促进作用。同时关联性分析表明，LD1与两种羊产羔数显著相关。蒙古羊群体除c.185G>A (R62H) 位点之外，剩余位点均满足哈迪温伯格平衡；由于乌珠穆沁羊c.82A>G、c.546C>T仅有一种基因型以及c.185G>A (R62H) 仅有两种基因型而不满足哈迪温伯格平衡，其余均满足，这表明实验群体在理想的环境下，各等位基因频率在遗传中是稳定不变的，即保持着基因平衡。由此我们推测c.240C>T和c.279C>T（LD1）能够调控绵羊繁殖性状，可作为与蒙古羊和乌珠穆沁羊产羔数相关的分子标记，也可能适用于其他品种体系中。
对于已知突变位点的研究，由于本研究未检测到rs428867159和rs405459906位点，所以不做讨论。在R62H位点中，250个蒙古绵羊试验群体中GG基因型243只，AA基因型7只，且R62H基因型频率不符合哈迪温伯格平衡。因此，并不能推测出R62H在蒙古羊和乌珠穆沁羊产羔数的相关性和作用。然而，该位点在蒙古羊双羔群体和单羔群体产羔数的等位基因频率分析中有显著差异（P < 0.05），暗示该位点可能与蒙古羊产羔数有关，但仍需在大样本群体中进行验证。
4.2 LEPR各突变位点对基因功能的影响
LEPR基因的c.240C>T和c.279C>T（LD1）是首次被证实与蒙古羊和乌珠穆沁羊产羔数相关的新突变位点。虽然该位点是同义突变不会改变氨基酸序列，但同义突变仍会影响mR NA的表达、剪接、稳定性[239,240,241]和二级结构[242,243]，以及蛋白质的翻译、折叠[244]和功能[245]。在本研究中，c.240C>T的MFE由 -67.70 kcal/mol增加到 -66.90 kcal/mol，c.279C>T的MFE由 -67.70 kcal/mol降低到 -70.40 kcal/mol；MFE的降低可导致mRNA二级结构的稳定性增加[242,243]。有研究表明，随着mRNA的最小自由能降低，mRNA的稳定性增加，致使了MTHFR基因表达的变化[246]。Duan等（2003）报道了同义突变导致mRNA稳定性和翻译的下降，并显著改变了多巴胺诱导的DRD2基因表达上调[239]。此外，研究发现突变的存在可以由碱基对的改变而改变其发夹构象，从而改变初级mRNA的自由能[247]。因此，c.240C>T和c.279C>T（LD1）可能会改变LEPR基因的mRNA的二级结构。有研究表明，即使是单个碱基对的交换也会导致mRNA二级结构和mR NA稳定性的改变[248,249]。在湖羊繁殖性状研究中，发现ADAMTS1基因第5外显子的同义突变g.127753565T>C位点与湖羊产羔数显著相关[250]。GDF9基因和TGFBR2基因同样存在两个同义突变与湖羊产羔数显著相关[251]。在绵羊的其他性状的研究中发现，FAT1基因的四个同义突变与中国美利奴羊的羊毛卷曲度、羊毛纤维长度和平均羊毛纤维直径显著相关，这4个同义突变可能影响中国美利奴羊的mRNA前剪接或改变mRNA二级结构[252]。根据关联性分析和生物信息学研究的结果显示，c.240C>T和c.279C>T突变可能导致绵羊生殖性状LEPR基因的潜在功能突变，它可能通过改变LEPR的mRNA稳定性和二级结构来影响绵羊的产羔数。
5、结论及创新点
5.1 本研究的结论
综上所述，LEPR基因的c.240C>T和c.279C>T突变与蒙古羊和乌珠穆沁羊产羔数显著相关。c.240C>T和c.279C>T突变可能通过影响LEPR基因的mRNA的最小自由能来改变mR NA二级结构及其稳定性。另外c.547C>T (H182Q) 和c.743C>T (T248I) 突变可能影响LEPR蛋白的三级结构。本研究结果为提高蒙古羊系绵羊品种的繁殖力的育种提供了有价值的分子遗传标记，并为LEPR基因的功能研究提供了新的可能。
参考文献（略）
