农学论文哪里有？本研究成功构建了CsCMV的cD NA侵染性克隆及其三种表达GFP的病毒表达载体，为后续开展CsCMV病毒基因功能和致病机制研究奠定了坚实的基础。
1 文献综述
1.2 国内外研究现状
1.2.1 木薯概况
木薯又称南阳薯、树薯，是大戟科（Euphorbiaceae），木薯属（Manihot）亚灌木状多年生作物，主要生长在热带、亚热带地区，与马铃薯、甘薯并称为世界三大薯类作物。从植物遗传学及考古学研究中发现，木薯作为一种古老的植物起源于南美洲亚马逊河流域，从16世纪开始，木薯在非洲、亚洲的大部分热带地区广泛种植，到21世纪初，木薯已经成为全球重要的粮食作物之一[26, 27]。木薯因其适应性强，受气候影响小，生长周期灵活，适应于各种地形，且地下块茎可保存数月，被热带地区人们称为“粮食银行”[28, 29]。自19世纪20年代引入我国后，现今木薯广泛种植在我国华南地区，以广西、广东和海南等地为主要栽培区[30, 31]。
木薯的种子萌发率较低，有性繁殖的木薯生长周期长，植株矮小，淀粉产量低，故一般木薯种植都采用扦插繁殖，将木薯的种茎浅埋入土壤中，在种植6-8个月后便可收获块茎[32]。木薯作为碳水化合物生产量最高的作物，其块茎具有丰富的淀粉含量（20%-40%），且木薯种植不需要投入太多人力物力便可以收获颇多，是热带亚热带地区农民的重要农业经济来源[33-35]。根据联合国粮农组织（FAO）统计，截止到2019年全球有100多个国家种植木薯，其中非洲木薯产量占全球总产量的一半以上，是全球最大的木薯种植产区[36]。在我国，由于耕地有限，木薯种植与粮、蔗争地的矛盾日益突出，2019年我国木薯单位面积产量仅为16687千克/公顷[28]。
3 结果与分析
3.1 CsCMV-HN全长cDNA侵染性克隆pCsCMV-HN的构建
3.1.1 CsCMV-HN全长cD NA片段和载体片段的RT-PCR扩增
以双元载体pGreenII-35S为骨架，采用In-Fusion无缝克隆的策略，一步法将CsCMV-HN的全长基因组序列克隆到pGreenII-35S载体上构建其侵染性克隆（图3-1）。首先以感染CsCMV-HN的木薯病叶提取植物总RNA，对其RNA浓度和质量进行检测后，反转录合成第一链cD NA，然后以获得的第一链cD NA为模板，用引物CsCMV-5Fov/CsCMV30T-R进行PCR扩增获得CsCMV-HN的全长基因组片段1（图3-1B），大小为6453 bp；以质粒pGreenII-35S为模板，用引物CsCMVpGr-F/pGr35S-R进行PCR扩增获得载体片段2（图3-1B），大小为3235 bp。
4 讨论
4.1 CsCMV-HN全长cDNA侵染性克隆的构建及侵染性分析
目前已有PVX、狗尾草花叶病毒（Foxtail mosaic virus, FoMV）、PepMV、白三叶草花叶病毒（White clover mosaic virus, WCMV）等Potexvirus病毒已成功构建了病毒侵染性克隆[25, 102-104]。CsCMV是典型的Potexvirus病毒，自20世纪末首次鉴定CsCMV巴西分离物的全长基因组序列后，未见其侵染性克隆等相关研究报道。本研究是基于我们前期在我国大陆首次报道发现的CsCMV海南儋州Hainan-DZ分离物CsCMV-HN构建其侵染性克隆。
本研究利用In-Fusion无缝克隆将CsCMV-HN全长cDNA片段克隆到植物表达载体pGreenII-35S上，构建其全长cD NA侵染性克隆pCsCMV-HN。通过农杆菌注射接种本生烟产生明显的花叶症状，侵染效率达100%。表明侵染性克隆pCsCMV-HN对本生烟具有侵染性。同样通过农杆菌注射接种木薯扦插苗，经过病症分析，RT-PCR检测表明侵染性克隆在木薯中的侵染效率达100%。但农杆菌注射接种的本生烟和木薯扦插苗发病时间均晚于摩擦接种的野生型对照组，这或许是因为不同的接种方式对病毒侵染效率的影响不同。研究表明，摩擦接种是通过金刚砂或石英砂等研磨剂在植株叶片表面造成微伤口，核酸可以直接通过叶片表面破损的细胞壁进入细胞中，从而侵染植株[105]。而农杆菌注射接种是基于双元载体，将病毒基因组全长插入到根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA区构建重组质粒，再将其导入农杆菌侵染植株[76]。在侵染过程中病毒需要先进行转录，通过细胞核孔从细胞核转运到细胞质中进行翻译，然后才开始在植株中复制运动[106]。所以我们猜测可能是因为农杆菌介导法需要先进行病毒的转录，导致其在发病周期上与摩擦接种的野生型植株有差异。该现象普遍存在于黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV），柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV），大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）等侵染性克隆[107-109]。由于不同的接种方法对寄主的侵染效率不同，因此后期可以尝试通过其他接种方式分析pCsCMV-HN的侵染效率。
4.2 CsCMV-HN全长cDNA侵染性克隆在大肠杆菌（E. coli）中的稳定性分析
研究表明，较大的病毒基因组和/或病毒序列的毒性作用导致其在大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）中的不稳定性问题，从而给一些病毒的侵染性克隆的构建带来极大挑战，因此，病毒侵染性克隆的构建通常成为限制开展病毒研究的关键因素[100]。本研究团队前期在构建番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV）和番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus, PRSV）的侵染性克隆时就发现其在E. coli中存在不稳定现象，为此建立了采用插入内含子和E. coli-free的策略一步法快速构建其体外转录和体内转录侵染性克隆的方法[110-113]。
本研究基于前期建立的方法，利用In-Fusion无缝克隆一步法快速构建CsCMV-HN适用于农杆菌注射接种的侵染性克隆和携带GFP的病毒表达载体。有意思的是，本研究中构建CsCMV-HN的全长cD NA侵染性克隆在E. coli中并未出现不稳定现象，菌液PCR鉴定的阳性克隆率为70.6%。可见不同病毒之间存在着较大差异，推测可能与CsCMV具有仅约6.4 kb的较小基因组或其病毒序列在E. coli中不具有毒性作用或毒性较弱有关。但构建CsCMV-HN的GFP表达载体pCsCMV-GFP时的阳性克隆率仅为12.5%，菌液PCR结果显示的假阳性克隆均不含GFP插入片段，推测是由于PCR扩增片段a的回收产物未经限制性内切酶DpnⅠ消化，使回收片段a中混有PCR扩增模板质粒pCsCMV-HN，导致其阳性检测率低。并且这种现象在后期构建的CsCMV-HN病毒表达载体pCsCMV-GFP-m1和pCsCMV-GFP-2A的阳性克隆中并未出现，其阳性克隆率分别为67%和73%，进一步证明，构建较小基因组的病毒侵染性克隆在E. coli具有较好的稳定性，这为构建其他Potexvirus属病毒或基因组较小的RNA病毒提供参考。
5 结论
1、本研究利用In-Fusion无缝克隆方法成功构建了CsCMV-HN全长cD NA侵染性克隆pCsCMV-HN，接种本生烟和木薯扦插苗的侵染效率达100%。
2、利用重复CsCMV CP亚基因组启动子（SGP）表达外源基因策略，成功构建了2种表达GFP的CsCMV载体pCsCMV-GFP和pCsCMV-GFP-m1：pCsCMV-GFP和pCsCMV-GFP-m1分别包括90 bp和171 bp的CP亚基因启动子（SGP）；农杆菌注射接种后通过荧光观测，RT-PCR和Western blot结果显示：pCsCMV-GFP和pCsCMV-GFP-m1均可以介导GFP在本生烟和木薯植株中系统过表达GFP，且pCsCMV-GFP-m1检测到的GFP荧光信号更强，GFP表达更高。
3、利用口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）的2A多肽与CsCMV CP融合串联表达外源基因策略，成功构建了表达GFP的CsCMV载体pCsCMV-GFP-2A，农杆菌注射接种后通过荧光观察、RT-PCR和Western blot结果显示：pCsCMV-GFP-2A可通过感染本生烟系统性过表达GFP，但不能介导GFP在木薯植株中表达。
4、本研究成功构建了CsCMV的cD NA侵染性克隆及其三种表达GFP的病毒表达载体，为后续开展CsCMV病毒基因功能和致病机制研究奠定了坚实的基础。
参考文献（略）
