本文是农学论文，利用SSR分子标记鉴定了2017-2019年河北省拟审定的72个林木良种。探索出SSR标记应用于品种鉴定的优缺点，其中重要的一个缺点为，无法得出确切的肯定结论。同时找到近年来河北省良种送审的规律，审定品种较侧重于以现有资源为基础的选择育种，且林木良种培育的对象偏向于果品类经济林木。（2）分析得知木槿不同组织转录组SSR差异较小。利用三个组织转录组综合数据，设计出EST-SSR引物，从60对引物中筛选出10对条带清晰、多态性好的引物。当子代扩增谱图中出现差异谱带，可直接得出不是亲子代关系的结论，但如果未出现差异谱带，由于检测位点数少，得到的结论就只能是不排除亲子代可能，并不是完全肯定确切的结论。由于SSR标记可以在物种间或同一物种不同品种间呈现很高的多态性［12］，因此尤其适用于选育品种的差异鉴定。在植物育种研究中，SSR分子标记主要有4大方面的应用：遗传连锁图谱的构建；遗传多样性研究；辅助选择和品种鉴定。遗传连锁图谱本质上是物种的染色体图，能反映基因以及多态性标记之间的相对位置。传统遗传连锁图谱是以植物形态特征的差异和生理生化指标为基础，对各性状进行连锁分析，但这些标记对于基因组的覆盖率不高，遗传连锁谱图的制作难度及工作量都很大。
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1引言
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，一般指种内的遗传多样性，反映种内个体间或群体内不同个体的总遗传变异。在育种工作中，需要遗传多样性分析对新品种进行系统化分类。SSR标记多态性良好、易于与基因连锁，揭示的等位基因数比其它任何标记都多，因此能有效地揭示生物物种的遗传多样性。利用SSR标记可以分析不同品种间亲缘关系，继而对这些品种系统化分类，有利于对各品种遗传背景的深入研究，可以有力的推动育种工作的进一步开展。目前SSR分子标记己成为研究植物遗传多样性的一种重要方法。SSR标记辅助选择。分子标记辅助选择，即通过检测与目标性状紧密连锁的分子标记的有无来间接确定目的基因的有无［71］。SSR分子标记遗传稳定性好，是共显性分子标记，能有效判断多倍体纯杂合性。SSR在植物的基因组或转录组中广泛分布，由高度变异的核心序列和高度保守的侧翼序列组成，可以根据两端高度保守的侧翼序列针对性地设计PCR扩增引物。SSR标记辅助选择周期短、成本低，不受环境因素的影，己经得到广泛的应用。
农学论文范文
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2材料与方法
2.1试验材料
为了在一定程度上完善我省林木良种审定体系，同时进一步规范我省林木品种管理工作，本研究将2017年至2019年河北省拟审定的72个新品种和374个对照种进行DNA鉴定，探索SSR分子标记对不同鉴定类型（杂交鉴定、选育鉴定和芽变鉴定）的应用，并分别建立最适当的鉴定方法，以期为后续的良种审定工作提供一定的理论依据；对此三年品种审定的数据进行统计分析，以期发现品种审定工作存在的某些特点和规律，从而掌握审定良种的集中点和侧重点；同时基于转录组测序技术对木槿进行SSR引物开发，以期为以后木槿品种的审定提供引物支持。林木品种鉴定的方法多种多样，在此对常用的一些鉴定方法进行比较和分析，发现传统的形态鉴定法直观简单，但易受植物生长环境和人为主观因素等的影响，鉴定结果不稳定；物理化学鉴定法快速便捷，但经常要求鉴定品种具有某些特异反应，在应用上易受到限制［5］；生化鉴定法的应用原理是通过蛋白质电泳图谱来反映品种间蛋白质组成的差异，存在的缺陷是不易鉴别遗传相近的品种，且在品种鉴定中可供用的蛋白质种类有限［6］；品种鉴定其实是鉴定品种的基因型，而DNA分子标记指纹图谱鉴定法就是在DNA水平上分析品种间的差异，与其他鉴定方法比较，具有稳定、准确、多态性丰富等的优势。分子标记技术与其他标记，例如形态标记、细胞标记和生化标记等的不同之处在于它能基于DNA的多态性直接反映DNA水平上的遗传变异，且鉴定准确性高，稳定性好，能很好地应用于林木品种鉴定。
为了在一定程度上完善我省林木良种审定体系，同时进一步规范我省林木品种管理工作，本研究将2017年至2019年河北省拟审定的72个新品种和374个对照种进行DNA鉴定，探索SSR分子标记对不同鉴定类型（杂交鉴定、选育鉴定和芽变鉴定）的应用，并分别建立最适当的鉴定方法，以期为后续的良种审定工作提供一定的理论依据；对此三年品种审定的数据进行统计分析，以期发现品种审定工作存在的某些特点和规律，从而掌握审定良种的集中点和侧重点；同时基于转录组测序技术对木槿进行SSR引物开发，以期为以后木槿品种的审定提供引物支持。林木品种鉴定的方法多种多样，在此对常用的一些鉴定方法进行比较和分析，发现传统的形态鉴定法直观简单，但易受植物生长环境和人为主观因素等的影响，鉴定结果不稳定；物理化学鉴定法快速便捷，但经常要求鉴定品种具有某些特异反应，在应用上易受到限制［5］；生化鉴定法的应用原理是通过蛋白质电泳图谱来反映品种间蛋白质组成的差异，存在的缺陷是不易鉴别遗传相近的品种，且在品种鉴定中可供用的蛋白质种类有限［6］；品种鉴定其实是鉴定品种的基因型，而DNA分子标记指纹图谱鉴定法就是在DNA水平上分析品种间的差异，与其他鉴定方法比较，具有稳定、准确、多态性丰富等的优势。分子标记技术与其他标记，例如形态标记、细胞标记和生化标记等的不同之处在于它能基于DNA的多态性直接反映DNA水平上的遗传变异，且鉴定准确性高，稳定性好，能很好地应用于林木品种鉴定。
2.2试验方法
本研究在常规试剂盒法的基础上略作改进后，对供试材料进行基因组DNA的提取，利用微量核酸检测仪对DNA纯度和浓度进行测定，再通过1%琼脂糖电泳进行DNA完整性检测，将较为完整、纯度较高且浓度高于50ng/VL的DNA样品用ddH20进行稀释。试剂盒组成及作用见表2-5。该试剂盒利用柱膜法进行样品DNA的提取。试剂盒法的改进：叶片研磨彻底后，加入1ml预处理液，离心，取上清，重复3次，此步是为了更加彻底的去除多糖，有些植物叶片含糖量高，容易在后续的过柱过程中粘附在柱膜上，影响离心过柱。于2020年5月在石家庄河北省林科院的试验基地进行采样。选择木槿品种‘蓝莓冰沙’作为转录组测序材料。采集‘蓝莓冰沙’茎部、叶片、花瓣3个组织共3个样本。采集时用无菌水冲洗干净，再用吸水纸吸干样品表面，将样本分割成100mg左右的小块立即液氮速冻。并放入预冷的15ml离心管中，-80°Ｃ保存。样本管放入自封袋，大体积干冰包裝，寄送到北京诺禾致源生物信息科技有限公司，由其提取基因组RNA并进行转录组测序。目前，在林品种鉴定中常用的分子标记技术。据相关报道称，SSR分子标记是目前最适用于品种鉴定的分子标记技术之一。分子标的发展，使得基于SSR分子标记的遗传连锁图谱构建迅速兴起。SSR标记具有基因组覆盖率高，工作量较少等的优点，而被广泛应用于遗传连锁图谱的构建
本研究在常规试剂盒法的基础上略作改进后，对供试材料进行基因组DNA的提取，利用微量核酸检测仪对DNA纯度和浓度进行测定，再通过1%琼脂糖电泳进行DNA完整性检测，将较为完整、纯度较高且浓度高于50ng/VL的DNA样品用ddH20进行稀释。试剂盒组成及作用见表2-5。该试剂盒利用柱膜法进行样品DNA的提取。试剂盒法的改进：叶片研磨彻底后，加入1ml预处理液，离心，取上清，重复3次，此步是为了更加彻底的去除多糖，有些植物叶片含糖量高，容易在后续的过柱过程中粘附在柱膜上，影响离心过柱。于2020年5月在石家庄河北省林科院的试验基地进行采样。选择木槿品种‘蓝莓冰沙’作为转录组测序材料。采集‘蓝莓冰沙’茎部、叶片、花瓣3个组织共3个样本。采集时用无菌水冲洗干净，再用吸水纸吸干样品表面，将样本分割成100mg左右的小块立即液氮速冻。并放入预冷的15ml离心管中，-80°Ｃ保存。样本管放入自封袋，大体积干冰包裝，寄送到北京诺禾致源生物信息科技有限公司，由其提取基因组RNA并进行转录组测序。目前，在林品种鉴定中常用的分子标记技术。据相关报道称，SSR分子标记是目前最适用于品种鉴定的分子标记技术之一。分子标的发展，使得基于SSR分子标记的遗传连锁图谱构建迅速兴起。SSR标记具有基因组覆盖率高，工作量较少等的优点，而被广泛应用于遗传连锁图谱的构建
3结果与分析..........12
3.1不同类型品种鉴定..........12
3.2木槿不同组织转录组差异分析..........21
4讨论..........36
4.1我省良种审定现状及SSR鉴定不同类型品种..........36
4.2不同组织差异表达基因的分析..........36
5结论........38
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3.2木槿不同组织转录组差异分析..........21
4讨论..........36
4.1我省良种审定现状及SSR鉴定不同类型品种..........36
4.2不同组织差异表达基因的分析..........36
5结论........38
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4.讨论
4.1我省良种审定现状及SSR鉴定不同类型品种
开展林木良种审定工作有利于科学推广林木良种，规范良种生产、经营和推广秩序，培育健康的种苗市场，实现林业生产力高质量快速地发展。我省积极响应国家号召，自2008年开始，将DNA指纹鉴定纳入林木良种审定必备程序中，2017-2019连续三年共审定72个新品种，其中大多数为果品类经济树种，覆盖我省苹果、梨、桃的大部分品种。由此可见，我省林木良种培育对象偏向于果品类经济树种，基于这种现状，我省应加强其他高价值林木品种的培育，审定的树种，不能局限于目前生产上使用的主要经济树种及部分观赏树种。形态学鉴定法、物理化学鉴定法和生化鉴定法均可应用于杂交种的亲本鉴定，但是都有所限制。SSR分子标记技术是从基因的水平上进行鉴定，较其他3种方法，更适用于杂交品种的鉴定，鉴定结果准确有效。拟审定种的父母本均被指定时，鉴定工作更容易进行，指定一方或均未被指定时，鉴定工作难度较大，需要更多的引物进行扩增。
开展林木良种审定工作有利于科学推广林木良种，规范良种生产、经营和推广秩序，培育健康的种苗市场，实现林业生产力高质量快速地发展。我省积极响应国家号召，自2008年开始，将DNA指纹鉴定纳入林木良种审定必备程序中，2017-2019连续三年共审定72个新品种，其中大多数为果品类经济树种，覆盖我省苹果、梨、桃的大部分品种。由此可见，我省林木良种培育对象偏向于果品类经济树种，基于这种现状，我省应加强其他高价值林木品种的培育，审定的树种，不能局限于目前生产上使用的主要经济树种及部分观赏树种。形态学鉴定法、物理化学鉴定法和生化鉴定法均可应用于杂交种的亲本鉴定，但是都有所限制。SSR分子标记技术是从基因的水平上进行鉴定，较其他3种方法，更适用于杂交品种的鉴定，鉴定结果准确有效。拟审定种的父母本均被指定时，鉴定工作更容易进行，指定一方或均未被指定时，鉴定工作难度较大，需要更多的引物进行扩增。
2017年河北省品种审定试验材料
4.2不同组织差异表达基因的分析
本研究基于转录组测序，从设计得到的木槿SSR引物中，筛选出60对进行扩增验证，发现有48对引物均能扩增出清晰的目的条带，有效扩增率为80%。对48对有效性引物进行多态性分析，有10对引物多态性理想，多态性率为16.67%。10对引物共扩增出38个条带，平均每对引物扩增条带数为3.8条，其中多态性条带有29条，占总条带数的76.32%。赵艺璇等1981利用SRAP法从256对SRAP引物中筛选出10对引物组合，这10对引物共扩增出88条明亮，无拖带，重复高的谱带，其中多态性条带72条，占总条带数的81.81%。肖芬1991在利用ISSR分子标记对27个木槿品种进行分类时，从100个ISSR引物中筛选出6对扩增条带清晰、多态性好的引物。以27个木槿品种为模板对6对引物进行扩增，多态性条带比率为83.33%。SRAP引物的设计原理是基因外显子内富含G、C而内含子和启动子中富含，对开放阅读框（ORFs）进行扩增，不同个体和种间就因为内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性EST-SSR检测的是相对保守的基因转录区，反映的是基因转录区微卫星位点的多态性，能够对基因内部变异进行直接评价，在同源及近源物种间显示出高度可转移性及多态性，而ISSR标记在扩增过程中扩增的是DNA序列中重复的片段。潘玉玲在构建丹参遗传连锁图谱时，就同时使用了这三种标记方法，最终得出三种标记方法同时使用可以优势互补，从而使遗传图谱的标记间的密度更均匀，更有效。
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本研究基于转录组测序，从设计得到的木槿SSR引物中，筛选出60对进行扩增验证，发现有48对引物均能扩增出清晰的目的条带，有效扩增率为80%。对48对有效性引物进行多态性分析，有10对引物多态性理想，多态性率为16.67%。10对引物共扩增出38个条带，平均每对引物扩增条带数为3.8条，其中多态性条带有29条，占总条带数的76.32%。赵艺璇等1981利用SRAP法从256对SRAP引物中筛选出10对引物组合，这10对引物共扩增出88条明亮，无拖带，重复高的谱带，其中多态性条带72条，占总条带数的81.81%。肖芬1991在利用ISSR分子标记对27个木槿品种进行分类时，从100个ISSR引物中筛选出6对扩增条带清晰、多态性好的引物。以27个木槿品种为模板对6对引物进行扩增，多态性条带比率为83.33%。SRAP引物的设计原理是基因外显子内富含G、C而内含子和启动子中富含，对开放阅读框（ORFs）进行扩增，不同个体和种间就因为内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性EST-SSR检测的是相对保守的基因转录区，反映的是基因转录区微卫星位点的多态性，能够对基因内部变异进行直接评价，在同源及近源物种间显示出高度可转移性及多态性，而ISSR标记在扩增过程中扩增的是DNA序列中重复的片段。潘玉玲在构建丹参遗传连锁图谱时，就同时使用了这三种标记方法，最终得出三种标记方法同时使用可以优势互补，从而使遗传图谱的标记间的密度更均匀，更有效。
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5结论
利用SSR标记技术鉴定林木品种由于长期的自然选择和人工培育，很多林木遗传背景愈渐复杂，同物异名和同名异物的情况普遍存在。品种鉴定的传统方法因为基因库的缩减和近亲品种的出现，准确性差、不稳定等的问题就越来越突出。SSR位点由于具有很高的突变率和不定向突变的特点，而且不受生长环境条件和生长周期的影响，可以有效稳定的对林木品种进行鉴定。目前己经被广泛地应用于林木品种鉴定工作中。鉴定选育品种时，审定种与对照种亲缘关系越接近，鉴定工作的难度就越大。亲缘关系越接近，SSR位点上相同基因数就越多，差异就越小。对扩增结果进行判断时，如果拟审定样品与对照相比出现了差异谱带，即可得出样品与对照存在差异的结论；如果未出现差异谱带，因为检测位点数不足，得出的结论只能是在鉴定所用引物上未检测到差异，同样不是完全确切的结论。SRAP和ISSR法扩增的条带数、多态性条带数高于EST-SSR引物，而EST-SSR引物的多态性率和平均多态信息含量高于SRAP引物和ISSR引物。对基因组扩增时引物结合位置的不同和扩增对象的不同，可能是产生差异的直接原因。
参考文献（略）
参考文献（略）
