本文是农学论文，SCAR标记引物Erc19的检测为进一步测试SCAR标记Erc19，我们对TaqMIX、温度、特异性及灵敏度均进行了检测。针对适用TaqMIX进行测试的结果显示，常用三种TaqMIX均产生了特异性扩增，而在这其中，效果最好的是艾科瑞2xProTaqMasterMix（dyeplus）。针对温度进行测试的结果显示在58.5℃到61.5℃范围内，引物特异性最好，61.5℃为最适温度。特异性测试中选择了11种常见病菌，提取DNA后用引物进行扩增。结果证实，在11种常见病菌中，SCAR标记仅对小麦网腥黑粉菌产生特异性扩增。将小麦网腥黑粉菌模板DNA浓度进行梯度稀释，使浓度分别为100ng/μL、50ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.1ng/μL、50pg/μL、25pg/μL、10pg/μL、1pg/μL。再利用SCAR标记引物Erc19对其进行扩增，测试SCAR标记的灵敏度。结果表明，标记在1ng/μL仍然会对网腥黑粉菌扩增出条带。（4）在SCAR标记的基础上开发qPCR引物以提高引物的检测水平在SCAR基础上，针对序列设计qPCR引物，对其灵敏度测试，并绘制扩增曲线、溶解曲线、对标记进行评估。实验结果证实，Qerc19溶解曲线峰值单一，产物的Tm值均一。本实验将针对小麦网腥黑粉菌，筛选对小麦网腥黑粉菌特异的ISSR引物，进一步开发SCAR引物及qPCR引物，并测试其灵敏度及特异性，以解决鉴定小麦网腥黑粉菌的问题。
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前言
小麦腥黑穗病是由小麦腥黑粉菌所引起的侵染性病害。除北纬25℃左右以南、年平均气温高于20℃以上的少数地区外，在我国各地都有发生。感染小麦腥黑穗病菌的小麦，分蘖增多矮小直立，成熟后小麦病穗变为黑褐色粉末呈鱼腥味，即病菌厚垣孢子。病粒孢子含三甲胺物质，对人体有害。由于小麦黑穗病特殊的发病方式，使得小麦黑穗病发病前期并无明显病状。引起小麦黑穗病的三种病原菌在表观上差别不大，在显微镜下能通过网脊大小等加以区分。因此，小麦腥黑穗病的危害前期鉴定难度大且费时费力，使得在对其预防及农户止损变得很困难。ISSR标记作为分子标记中基于微卫星开发出来的标记技术，ISSR标记拥有RPLF标记的高敏感性、高特异性，同时也克服了RPLF的难重复性的缺点，PCR扩增使用的引物更长，PCR中使用的退火温度更高。与RAPD一样，ISSR几乎不需要事先的靶序列知识，因此可以轻松地应用于非模型物种。基因组中微卫星的丰富性及其在同一物种以及不同物种之间的高变异性确保了ISSR标记的实用性。SCAR标记是基于ISSR标记开发的单一条带的特异性引物。SCAR标记克服了任意标记固有的敏感性、多态性和难重复性。SCAR引物因为具有序列特异性的优点，结果可靠、稳定性高。同时将任意标记的多态性转化成条带的有无也同样使结果更加直接清晰。目前小麦腥黑穗病的其他两种病原菌小麦光腥黑粉菌、小麦矮腥黑粉菌都已建立成熟的SCAR标记鉴定引物。
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第一章小麦腥黑穗病及分子标记研究进展
1.1小麦腥黑穗病概况
在我国发生的小麦黑穗病中，主要以小麦腥黑穗病为主，其萌发适温16-20℃，侵入麦苗适温5-20℃。受气候条件的影响，我国除滇、粤、台三省南部少数地区外，其余省市年平均气温都在20℃以下（何春雨等，2012）。小麦腥黑穗病在全国各地都有发生，在华北、华东、西南的部分冬麦区及东北、西北和内蒙古春麦区发生较重。在20世纪60至70年代，全国各地对腥黑穗病的检疫、抗性品种的推广，使其在全国得到有效控制，但最近几年农民自发留种，外调种源的情况变多，拌种处理减少，特效防治药剂的缺失，特别是抗性品种的减少导致腥黑穗病发病的情况逐年增加（张英霞，2018）。近些年在河南、河北、山东、安徽、山西、甘肃和上海等都有不同程度的发生。2016年山西省临汾市乡宁县北家村和西坡村就出现腥黑穗病严重发生的现象，部分麦田腥黑穗病发病率占全部麦穗的70%左右。小麦腥黑粉菌在小麦苗期侵染后，受侵染的小麦与正常小麦并无过多区别，直到麦穗成熟后才会有明显的穗部病症，所以极其需要前期就能准确鉴定、区别腥黑粉菌的方法。通过光学显微镜观察冬孢子，观察有无网脊及网脊大小来区分不同腥黑粉菌（梁宏等，2006）。近些年来随着分子标记技术在小麦真菌病害中的不断开发与应用，针对不同腥黑粉菌的分子标记也接不断的被开发出来。目前已有针对小麦矮腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌的特异性引物（高飞等，2008），但是尚未开发出小麦网腥黑粉菌特异的引物。
1.2分子标记技术介绍
DNA标记技术始于限制性片段长度多态性（RFLP）标记的开发，用于构建人类基因组的第一个分子图。RFLP提供了一种方式，可以在各种来源的基因组DNA进行限制性消化后，检测不同长度的DNA片段的有无。琼脂糖凝胶电泳和Southern印迹后，将限制性片段与短，单拷贝基因组或cDNA放射性标记探针杂交，并通过放射自显影显示。通常，与几种核酸内切酶组合筛选不同的探针，每种组合在特定位点产生单独的独特RFLP模式。因此，这些标记物除了共同作用外，还鉴定出独特的基因座。总而言之，RFLP标记对于区分不同的基因型非常有用且可靠的。但是RPLF同样有他的局限性体现在，需要大量的高分子量DNA（5-20mg），相关的物种通常可能拥有相同的等位基因。就每个基因座的杂合性和每个基因座的等位基因而言，RFLP的分辨率不如其他标记。观察现象时放射性和染色技术也对人体的影响。RFLP的另一个重要限制是它们在基因作图中的使用受到限制，因为由于RFLP探针的单拷贝，单基因座性质，在RFLP分析中经常忽略基因组中的重复区域。后来几年，基于PCR的技术的这些局限性和主导地位共同导致了RFLP标记的没落，但必须承认RPLF仍是基因组学，转录组学乃至复杂的分子标记（例如微卫星）的许多后续发展的基础
第二章材料与方法...........................................................................................18
2.1试验材料.......................................................................................................................18
2.2实验方法.......................................................................................................................21
第三章结果与分析...........................................................................................28
3.1DNA提取结果..............................................................................................................28
3.2ISSR引物筛选结果......................................................................................................28
3.3SCAR标记引物的设计及检测....................................................................................28
3.3.1SCAR标记引物的设计.........................................................................................29
3.3.2SCAR引物Erc19扩增MIX及最佳温度的测试................................................30
3.3.3SCAR标记引物的特异性，灵敏度检测.............................................................32
3.3.4实时荧光定量PCR引物设计..............................................................................33
第四章结论与讨论...........................................................................................35
4.1结论................................................................................................................................35
4.2讨论...............................................................................................................................36
4.2讨论...............................................................................................................................36
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第三章结果与分析
3.1DNA提取结果
试验中采用CTAB方法对待测菌种（表2-1）提取了基因DNA，用核酸测定仪检测了提取DNA浓度，所有菌株DNA浓度在100ng·μL-1至260ng·μL-1之间（表3-1），由此可见，提取效果良好，提取质量与数量均能满足本试验的需要。本试验共选用ISSR801-900的100条ISSR引物用于小麦网腥黑粉菌筛选试验，经过反复筛选后发现ISSR8275’-3’ACACACACACACACACG引物可以得到相对稳定且清晰的扩增条带（如图3-1所示），表明ISSR827对小麦网腥黑粉菌最具特异性，大小为515bp，该引物可用于SCAR标记引物的设计。为进一步测试引物Erc19的特异性，以小麦网腥黑粉菌、小麦矮腥黑粉菌、小麦光腥黑粉菌、玉米黑粉菌、小麦散黑粉菌、大麦坚黑粉菌、小麦条锈菌、小麦叶锈菌、小麦秆锈菌、禾本科布氏白粉菌、禾谷镰刀菌等11种作物病原菌的DNA作为模板进行扩增，对Erc19进行特异性鉴定。结果表明，在供试的病原菌中，只有在小麦网腥黑粉菌扩增到了预期大小的特异带，而其他对照病原菌均没有条带（图3-7）。小麦是三大谷物之一，几乎全作食用，仅约有六分之一作为饲料使用。近几年对于农药等化学防治手段进行严控的同时，不同种的小麦病害发生情况呈现上涨趋势。因此早发现早预防成为了防治的主要手段。
特侧菌种DNA浓度
3.2ISSR引物筛选结果
前期实验已经对小麦光腥黑粉菌，小麦矮腥黑粉菌设计出特异性引物，本论文以此为基础，对小麦网腥黑粉菌为研究对象。成功发现可鉴定小麦网腥黑粉菌的ISSR引物ISSR827，并成功将ISSR827转化为SCAR引物Erc19。进一步的灵敏度，特异性测试结果都证明Erc19在常见病原菌中能鉴定小麦网腥黑粉菌。进一步基础上开发了qPCR引物Qerc19，通过绘制溶解曲线，扩增曲线证明Qerc19具有对小麦网腥黑粉菌的特异性，并成功绘制标准曲线。随着近几年间世界全球化进程的持续推进的过程中，国际间将会有大规模的经济往来。中国人口众多，保障国家粮食安全始终是治国理政的头等大事。小麦作为三大谷物之一在我国广泛种植，但不科学的种植密度及种植方式使得小麦病害时有发生（张英霞，2018）。而小麦腥黑粉菌的特殊发病机制和病害发生程度使得其一旦发生就会造成大量减产甚至于绝收，值得一提的是，近几年对农药的管控以及种植户对腥黑穗病的不重视使腥黑穗病再次爆发的可能性大大提升，所以先进的鉴定方式尤其重要（吴秀芹等，2018）。本文成功开发并测试对小麦网腥黑粉菌的SCAR引物Erc19，填补了在网腥黑粉菌中特异引物的空白。但是对已经患病的小麦的植株是否能准确鉴定目前只停留在经验层面，没有获得准确量化的结果。对针对小麦网腥黑粉菌QPCR引物Qerc19的开发测试，在获得扩增曲线，溶解曲线并进行分析后我们肯定了Qerc19的特异性，同时绘制标准曲线成功获得了Qerc19的检测限，这使得精确测试成为可能。相信在不久的将来，我们能够成功开发一种快速、灵敏、准确检测小麦腥黑穗病的高通量试剂盒，这将为解决我国粮食安全问题提供方案
ISSR827菌落PCR
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第四章结论与讨论
获得了小麦网腥黑粉菌的特异性ISSR引物通过实验室培养小麦网腥黑粉菌、光腥黑粉菌和矮腥黑粉菌，使用CTAB法提取DNA并测定浓度后分别用ISSR801-900标记进行扩增。在凝胶电泳紫外灯下观察条带筛选对小麦网腥黑粉菌具有特异性的ISSR引物。结果表明，ISSR827引物在三种亲缘关系很近的小麦光腥黑粉菌，矮腥黑粉菌，网腥黑粉菌时起到了很好的鉴定作用。成功通过PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳紫外照射下成功的区分出小麦网腥黑粉菌，小麦光腥黑粉菌，矮腥黑粉菌。目前全球粮食安全问题日益严重，其中因作物病害造成的影响占重大比例。小麦做为世界上人类的主食之一，磨成面粉后可制作面包、馒头、饼干、面条等食物，发酵后可制成啤酒、酒精、白酒，或生物质燃料。小麦腥黑穗病是由腥黑粉菌引起的一类真菌病害。腥黑粉菌属于担子菌亚门冬孢菌纲黑粉菌目腥黑粉菌科腥黑粉菌属。在我国小麦腥黑穗病，主要是由小麦网腥黑粉菌小麦光腥黑粉菌导致，当土壤温度在5-10℃范围内时最佳感染，但当土壤温度在22℃范围内时感染减少（吴秀芹等，2018）。在病菌存在种子或土壤中时，孢子萌发并产生菌丝，在出苗前感染小麦胚芽鞘。在病株成熟后在花穗中繁殖，并在胚乳中形成孢子直到将整个麦粒转化成暗色孢子。病粒通常在收获处理时破裂释放孢子到土壤或种子里引发下一个侵染循环。
参考文献（略）
参考文献（略）
