本文是农学论文，苗徐静等[105]在研究冷训化过程中的草莓组培苗及恢复后的植株DNA甲基化水平及模式的变化，发现其甲基化水平的变化主要以去甲基化为主。本试验研究的是低温保存后的笃斯越橘组培苗和恢复后的组培苗的基因组DNA甲基化水平和模式的改变，发现其保存前后甲基化的水平变化不大，保存前后分别为：79.61%和80%，且甲基化模式主要是不变类型为主，其次是甲基化模式，再次是去甲基化模式的改变，这与苗徐静的试验结果不符，可能的原因：一是草莓是草本植物，耐寒能力本就没有笃斯越橘耐寒能力强；二是冷训化时间也比较短，低温保存时间比较久。基因组DNA甲基化MSAP技术虽然可以检测出甲基化类型和条带类型，但对于DNA甲基化位点的具体变异情况还有待深入研究。
........
1前言
目前，尽管植物组织离体保存研究已经相对成熟，应用范围也十分广泛，但目前关于笃斯越橘离体组织低温保存方面鲜有报道。国外学者的相关研究表明：耐寒植物、亚热带植物和热带植物低温保存温度一般分别为0-5℃甚至－3℃、10℃左右和15℃以上[34-36]。根据不同植物自身的抗寒能力，保存的温度也大不相同。2013年CamilaPereiraCarvalho等对一种热带凤梨科进行外植体的研究发现，外植体分别在5℃、10℃、15℃、25℃条件下保存30d和60d后进行生物化学和形态结构的检测和比较时，发现该外植体在5℃下无法存活，其能存活的最低温度为10℃。研究发现，相比于25℃，5℃和10℃的薄壁组织含水量和还原糖含量增加。相比于15℃，该植物在10℃的叶片叶绿素含量和生长速率降低。研究表明，该植物可以适应环境条件且生长缓慢的最佳温度是15℃，这一结论也符合前人关于低温保存的相关报道。影响低温保存的几个因素分别有外植体类型、培养基组成、培养基浓度、植物材料周围的氧气浓度、培养温度、光照强度等[38]。Ashmore等[39]发现相同植物不同的外植体类型，保存效果也不同。Mullin（1976）等用逐滴添加培养基的方法将草莓幼苗保存在试管中6a。有学者通过在保存材料上覆盖硅酮或者使用液体培养基的方法，来减少材料周围氧气密度，从而降低生长速度。但是Engelmann等(1999)认为这种方法有很多缺陷之处：例如外植体易发生玻璃化、保存材料复壮时出现再生慢、易坏死的现象等。目前使用最多，也最有效的方法是多种方法的综合应用。
......
2材料与方法
2.1试验材料
本次试验于2017年3月至2019年3月在东北农业大学园艺园林学院展开。试验材料为笃斯越橘优系SL-1；用于低温保存的材料为SL-1组培苗。
2.2试验方法
2.2.1组培苗的培养选取长势较好的无毒组培苗，用严格消毒后的手术刀在超净工作台里将其切成约1cm左右的带芽茎段后，常温培养20d后的组培苗备用。培养基为WPM+蔗糖20g/L+琼脂8g/L+ZT0.5mg/L，pH值为5.2，光照时间为14h/d，光照强度为1300lx，25±1℃下培养。首先用量筒量取适量的蒸馏水，加入所需WPM培养基、蔗糖、生长调节剂后搅拌均匀，调节pH值并定容，最后用电磁炉将其煮沸后加入琼脂粉，待其充分溶解后，迅速分装到培养瓶中，每瓶50ml。培养基在121℃高压灭菌20min后放入超净工作台中冷凝后备用。
.....
3结果与分析.............21
3.1培养基及培养条件对单芽茎段诱导分化的影响.....21
3.2低温保存的温度、培养基和培养环境的筛选.........24
3.3低温保存中笃斯越橘优系的植物学特征和生理生化变化..................29
4讨论.........................47
4.1培养基及培养条件对外植体增殖的影响.................47
4.2添加渗透调节类物质对组培苗低温保存的影响.....47
4.3低温保存过程中的影响因素及生理生化检测.........48
4.4低温保存中基因组DNA甲基化水平及模式变化...48
5结论.........................49
4讨论
4.1培养基及培养条件对外植体增殖的影响
本试验使用的WPM培养基，以单芽茎段作为外植体，优化其增殖培养基，结果发现，本试验中使用的3种TDZ的浓度（0.1、0.5、1.0mg/L）均不适宜做单芽茎段的扩增，而郑永春[100]用笃斯越橘的叶片作为外植体，进行组培苗的增殖扩繁试验，结果发现以B5为基础培养基，TDZ为0.4mg/L时，其繁殖系数可以达到7，增殖效果较好，郑永春的试验结果与本试验结果在这一点上不相符。可能的原因：一是本试验选用的TDZ与其他生长调节剂同时使用导致试验选取的浓度过大不适合单芽茎段扩增；二是本试验选用的外植体与前人选用外植体不同，外植体的不同也会影响试验效果；三是基础培养基的不同，不同培养基的营养配方也会影响试验结果。本试验在研究光照时间对外植体扩增的影响时发现：最大的繁殖系数是5.33，愈伤组织较大，培养基是：WPM+琼脂8g/L+蔗糖20g/L+ZT3.0mg/L，光照时间为10h/L。郑永春的结果与本结果有一定的相似之处，因为ZT和TDZ同属于细胞分裂素，作用相似，均可以促进外植体扩增分化。另外，ZT浓度为3.0mg/L时，本试验繁殖系数受光照时间的影响较大，光照时间为16h/d时，繁殖系数为2，愈伤组织较小，且随着光照时间逐渐减少，繁殖系数反而逐渐增大，可能的原因是短光照可能促进愈伤组织生长并分化成苗，长光照可能抑制愈伤组织生长并分化成苗，这还需要进行进一步的试验验证。综上所述，不同植物组织的扩增培养基受植物品种、外植体种类、生长调节剂浓度及培养环境的共同影响而不尽相同。
4.2添加渗透调节类物质对组培苗低温保存的影响
种质资源低温保存过程中，由于温度的降低，一般会导致植物生长较常温下缓慢，而且长时间的低温保存可能会导致植物遗传发生变异，为了使保存的种质生长缓慢，延长保存时间，同时为了避免遗传变异的发生，往往在种植资源低温保存的培养基中添加渗透调剂类物质或生长调节剂，如山梨醇、甘露醇、二甲基亚砜、蔗糖或脱落酸ABA、矮壮素CCC等。本试验保存的种质是笃斯越橘优系，材料是组培苗，研究中探讨了蔗糖、山梨醇、甘露醇等因素对保存结果的影响，结果表明，甘露醇不适合添加在WPM培养基中做笃斯越橘优系的低温保存培养基。臧玉文研究红香芋的离体常温保存时，分别使用了山梨醇、甘露醇、ABA和CCC共4种不同浓度，结果表明，添加使用ABA的保存时间可以达到150d，成活率72%，效果最佳[101]。而添加山梨醇或甘露醇的苗不断死亡，保存效果不好。这与本试验结果差异很大，可能的原因是保存的温度不同，本试验采用的是5℃低温保存，不同保存温度下附加渗透调节剂对植株的影响较大。王小乐在研究菊花低温离体保存试验时，发现在MS基础培养基上添加甘露醇时，不同品种菊花的最佳低温保存培养基的甘露醇的浓度也不尽相同[102]。吴京姬等[103]研究马铃薯试管苗长期保存时发现，温度10℃下，添加山梨醇后可将马铃薯试管组培苗延长保存1年。
.....
5结论
（1）笃斯越橘优系的单芽茎段最优诱导愈伤培养基为：WPM+TDZ0.5mg/L+ZT2.0mg/L；单芽茎段最佳诱导分化苗培养基；单芽茎段扩繁的最优pH值为5.2，单芽茎段扩繁的最佳光照时间为14h/d。2）笃斯越橘培苗最佳低温保存培养基为：WPM培养基+山梨醇20g/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L；最佳保存温度为5℃；保存单日光照时间为10h/d，pH值为5.2（3）低温保存中笃斯越橘优系组培苗生理生化指标会发生显著的变化，MDA含量、叶绿素a+b含量、脯氨酸含量和可溶性蛋白质含量是生理生化变化中四个主因素。（4）低温保存对组培苗基因组DNA影响不大，且复壮复壮两个月的组培苗比复壮一个月的组培苗相比，其甲基化不变类型A比较高，即复壮效果较好。（5）最佳保存时间为120d。复壮两个月的复壮效果更佳。
参考文献（略）
参考文献（略）
