鸭Mx蛋白体外抗RNA病毒活性的研究

本文是农学论文，本研究分别用四种 RNA 病毒水疱性口炎病毒（VSV）、新城疫病毒（NDV）、1 型鸭甲肝病毒（DHAV-1）和 3 型鸭甲肝病毒（DHAV-3）感染人胚胎肾上皮细（HEK293T），盲传 3 代后测定半数细胞培养物感染量（TCID50），最终测定 VSV、NDV、DHAV-1 和 DHAV-3的 TCID50分别为 10-5.164/0.1 mL、10-6.181/0.1 mL、10-7.748/0.1 mL 和 10-9/0.1 mL。提取 293T 细胞中四种病毒的 RNA，将其反转录为 cDNA，利用 PCR 技术扩增目的基因，构建了四种 RNA病毒的标准质粒，并以标准质粒为模板制作标准曲线，通过重复性、灵敏度和特异性检测，成功建立了分析病毒载量的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法。合成带有红色荧光标签的慢病毒穿梭质粒 pLV-mCherry-Mx-2166，利用脂质体转染技术将 pLV-mCherry-Mx-2166 导入293T细 胞 ， 并 对 转 染 剂 量 和 时 间 进 行 优 化 。在 293T 细胞中瞬时过表达鸭 Mx蛋白对 VSV、NDV、DHAV-1 和 DHAV-3 病毒的复制有显著的抑制作用。siRNA-Mx2 干扰载体体外可显著抑制鸭 Mx 抗 VSV、NDV、DHAV-1 和 DHAV-3 的活性。

1 前言

病毒侵染和双链 RNA 刺激 Mx 基因表达的分子机制与 I 型干扰素诱导机制有所差异。研究表明，病毒的靶结构通过多种方式与 DNA 序列上的干扰素激活反应元件 ISRE 互相用，进一步激活 Mx 基因表达[51]；双链 RNA 也是如此来调控 Mx 基因表达的。病毒诱导干扰素激活基因 ISGs 的表达与干扰素激活基因因子 ISGF-3 的表达是两个比较对立的的体系。当乏干扰素激活基因因子 ISGF-3 时，病毒和双链 RNA 诱导产生的一些 ISGs 会自动参于该程，所有这些因子在 N-端 DNA 结合域具备很高的同源性。Damell 等证明流感病毒感染细后，干扰素调节因子 1（IRF-1）的 mRNA 表达量快速升高，并且 IRF-1 基因与 Mx A 基因的诱导表达动力学高度相似。另外，干扰素调节因子 3（IRF-3）、双链 RNA 激活因子（DRAF-1、DRAF-2）也会起到调节 Mx 表达的作用，但具体的作用机制目前尚不明确49]。Mx 基因的表达受 I 型干扰素调节因子 IRF-1 和 IRF-2 的正负反馈双向调节。低浓度的IRF-1 能激活 ISGs 转录从而抑制 IRF-2 的表达，而过量的 IRF-2 也会抑制 IRF-1 的活性功能[52]。所以，当病毒侵染细胞或者用干扰素治疗人和动物机体后，IRF-1 和 Mx 基因的表达水平都会急剧增加，但是当 IRF-1 诱导 IRF-2 的表达后，IRF-2 的累积就会负反馈调节 IRF-1和 ISGF-3 因子，从而抑制 Mx 基因的表达。有研究推测该分子机制可能是：Mx 基因上的启动子序列包含有很多个 ISRE 位点，ISGF-3 和 IRF-l 因子可能都会结合一个 ISRE 位点从而起到协同促进 Mx 蛋白表达的作用[53]。

2 材料与方法

2.1 材料

HEK 293T人胚胎肾上皮细胞（简称293T细胞），由本实验室冻存；感受态细胞DH5α和TG1由本实验室制备保存；克隆载体pMD18-T simple Cloning Kit购自宝日医生物技术（北京）有限公司；表达载体pLV-mCherry-Mx-2166、pLV-mCherry-control由赛业（广州）生物科有限公司构建；鸡新城疫活疫苗La Sota株购自哈药集团生物疫苗有限公司，VSV、DHAV-1 E53株和DHAV-3毒株均由本实验室冻存。

2.2 方法

 RNA 取 NDV 活疫苗加入 1 mL 灭菌的 PBS 缓冲液溶解，按 1:500 和 1:1000 稀释，加入 10%比例的双抗（青霉素和链霉素），混匀之后，各接种两枚 9 日龄 SPF 鸡胚，鸡胚尿囊腔种病毒液 200 μL/胚，蜡封后置于 37℃恒温培养箱孵化，每天照蛋 3 次，观察胚胎存活情况，弃掉 24 h 以内死亡的鸡胚，在无菌操作台中收取 36~96 h 死亡的鸡胚尿囊液，放于 4℃冰箱内冷却使血管收缩。阴性对照组，无菌接种 PBS 200 µL/胚，接种 2 枚鸡胚。取 DHAV-1 和 DHAV-3 的冻干粉加入 1 mL 灭菌的 PBS 缓冲液溶解，按 1:1000 稀释，加入 10%比例的双抗，混匀之后，各接种两枚 11 日龄 SPF 鸭胚，鸭胚尿囊腔接种病毒液 200μL/胚，蜡封后置于 37℃恒温培养箱孵化，每天照蛋 3 次，观察胚胎存活情况，弃掉 24 h 内死亡的鸭胚，在无菌操作台中收取 36~96 h 死亡的鸭胚尿囊液，放于 4℃冰箱内冷却使血收缩。阴性对照组，无菌接种 PBS 200 µL/胚，接种 2 枚鸭胚。将收集好的 NDV、DHAV-1 和DHAV-3 的尿囊液置于-70℃保存备用。

3 结果与分析......................25

3.1 RNA 病毒在 293T 细胞中的繁毒及鉴定.................25

3.2 VSV、NDV、DHAV-1 和 DHAV-3 的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立......29

3.3 鸭 Mx 体外抗 RNA 病毒条件的优化.................41

3.4 siRNA 干扰鸭 Mx 表达条件的优化及鉴定.............................53

4 讨论..................................66

4.1 选择 293T 细胞瞬时过表达鸭 Mx 蛋白的依据.....................66

4.2 实时荧光定量 RT-PCR 方法的建立.........................................66

4.3 鸭 Mx 蛋白瞬时过表达条件的优化.........................................67

4.4 体外瞬时过表达鸭 Mx 抗 RNA 病毒活性的评价.................67

4.5 siRNA 干扰鸭 Mx 蛋白抗 RNA 病毒活性的评价..................68

5 结论..................69

4 讨论

4.1 选择 293T 细胞瞬时过表达鸭 Mx 蛋白的依据

293T 细胞是人胚胎肾上皮细胞，是一种常用来研究表达外源基因的细胞株，且 293T 细胞属于传代细胞可以无限传代，更便于瞬时表达的试验操作。2011 年，陈胜峰等将鸡的 Mx基因连接到 pEGFP-C1 载体中，经筛选鉴定成功后利用磷酸钙法转染 293T 细胞，并对转染细 胞进 行免 疫荧 光分 析以 及 RT-qPCR 和 Western blot 鉴 定， 结果 表明 ，试 验构 建的pEGFP-C1-cMx 重组质粒可以在 293T 细胞中高效表达，表达的鸡 Mx 蛋白对新城疫病毒有抗病毒活性[88]。2018 年，任红玉等将构建的禽呼长孤病毒σA 蛋白真核表达载体转染至 293T细胞中，证明了该蛋白可以在 293T 细胞中准确高效表达[89]。近年来，研究表明水疱性口炎病毒、乙型脑炎病毒、人星状病毒等人源病毒均可感染 293T 细胞，且猪圆环病毒 2 型腺病毒构建的重组病毒也可以感染 293T 细胞并在其中高效表达[90]。此外，新城疫病毒的基质蛋白 M 和禽细胞核磷酸蛋白 B23.1 在 293T 细胞中也存在相互作用[91]。在此之前关于 NDV、DHAV-1 和 DHAV-3 等 RNA 病毒是否能在 293T 细胞中繁殖还并未明确，本研究选择在293T细胞上尝试繁殖 NDV、DHAV-1 和 DHAV-3，经试验证实此 3 种 RNA 病毒均可感染 293T细胞，且使细胞产生明显的细胞病变，故可利用 293T 细胞进行后续相关试验的研究。

4.2 实时荧光定量 RT-PCR 方法的建立

常规 PCR 检测方法虽然快速，特异性较高，但不能准确定量，无法满足科研试验中对数据定量分析的要求；与常规 PCR 相比，荧光定量 PCR 不仅能够精确定量，而且特异性、敏感性更高，可靠性更强，且能进行多重反应。目前常用的荧光定量 PCR 方法分 Taq Man 探针法和 SYBR Green I 染料法，Taq Man 探针法容易受到高度互补序列的影响，可能出现假阴性的结果，且一般成本较高；荧光染料 SYBR Green I 能够与所有双链 DNA 结合可通过熔解曲线分析消除产生假阳性信号的影响[92]。2018 年，有研究建立了禽副黏病毒 6 型（APMV-6）SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 检测方法，经优化后线性关系良好，标准曲线 R2=0.998，E=107%。该方法最低检出拷贝数为 2.78×102copies/μL，与 NDV、APMV-4、APMV-13 和 GPV不发生特异性反应[93]。本研究利用荧光染料 SYBR Green I 建立了用于检测 VSV、NDV、DHAV-1 和 DHAV-3四种 RNA病毒的实时荧光定量 RT-PCR检测方法，优化后 VSV的标准曲线y=-3.1221x+40.831，R2=0.9918，E=109%；NDV 的标准曲线 y=-2.9804x+39.881，R2=0.9857，E=116%；DHAV-1的标准曲线 y=-2.9993x+39.104，R2=0.9798，E=115%；DHAV-3 的标准曲线 y=-3.0225x+38.164，R2=0.9932，E=114%。通种过重复性、灵敏度和特异性的检测，结果显示四种病毒的标准差均在 0.01~0.05 范围内的说明该方法重复性较好；四种病毒的最低检测限度分别为 54.5copies/μL、67.9 copies/μL、466 copies/μL 和 57.2 copies/μL；本研究只选择了 VSV、NDV、DHAV-1 和 DHAV-3 四种病原进行特异性检测，后期将会增加 DEV、DAstV 等病原再次进行特异性试验，使验证结果更加具有说服力。因为 RT-qPCR 检测的是病毒基因的拷贝数，可以间接反应病毒的增殖程度，所以，如果想确定病毒的含量还需要测定各病毒的 TCID50。