本文是一篇护理论文，由于心身疾病的治疗和转归与心理社会因素更加密切，病人的情绪状态和心理变化直接影响着疾病的治疗效果和康复程度，因此，对心身疾病的心理护理就显得格外重要。（以上内容来自百度百科）今天为大家推荐一篇护理论文，供大家参考。
引 言
缺血性脑血管疾病是目前导致人类死亡的重要原因之一，虽然脑血管病的诊疗水平在不断提高，但该疾病至今仍具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点。美国流行病学的研究预测，到 2030 年，发达国家 65 岁以上的老年人中约有 1/5 可能患有脑血管疾病[1]。目前我国人口老龄化不断加剧，脑缺血性相关疾病的发生率呈逐渐上升的趋势，脑血管疾病已成为威胁人类健康的三大死亡原因之一。因此，有必要积极寻求切实有效的防治脑缺血性疾病的方法。大脑是人体对缺氧最敏感的器官，缺血性脑血管疾病是由于脑动脉血流短暂或持久减少引起的，最终导致脑组织缺血缺氧[2]。研究证实，脑缺血时位于梗塞核心的神经元往往发生快速坏死性死亡，位于缺血半影区的神经元发生延迟性死亡，这种延迟性死亡主要表现为细胞凋亡，并且半影区延迟性死亡决定了最终的梗塞面积[3, 4]。因此，通过抗凋亡的作用抑制缺血神经元的凋亡，将有助于缺血性脑血管病的防治。
BAG-1 是一种可以编码多功能蛋白的抗凋亡基因，最初研究表明它是一种BCL-2 结合的抗凋亡分子，后续研究发现 BAG-1 可以与热应激同源蛋白(heat shockcognate protein 70, HSC70）/HSP70、激素受体等多种细胞内分子结合，参与细胞凋亡、增殖和信号传导等，其中凋亡调控作用最为重要[5]。HSP70 是热休克蛋白家族中研究最为深入的成员之一，国内外众多研究证实 HSP70 对脑缺血性疾病具有保护性作用。BAG-1 主要有 4 种亚型，BAG-1L，BAG-1M，BAG-1S 和 p29。各种亚型的 C-末端都具有 BAG 功能域，可与 HSP70 的 ATP 酶结构域结合，形成一个有功能的活性构象并调控其功能。已有研究报道 BAG-1 与 HSP70 相互作用在细胞凋亡中发挥作用，但其在缺血性脑血管病中的神经保护作用及其机制尚不明确。因此，本课题通过重组慢病毒感染体外培养的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y），研究外源性 BAG-1L 过表达对缺氧状态下细胞的保护作用，以及对 HSP70 表达的影响，并进一步探讨其对 PI3K/AKT 通路的影响，为临床上脑血管病的防治提供分子水平上的科学依据和新的思路。
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材料和方法
1 仪器、试剂和耗材
1.1 主要设备和仪器
（1）二氧化碳培养箱（美国 Thermo 公司）（2）超净工作台（中国苏州苏净公司）（3）倒置荧光显微镜（日本 Olympus 公司）（4）高压灭菌器（日本 Panasonic 公司）（5）普通光学显微镜（日本 Olympus 公司）（6）可调式微量移液器（德国 Eppendorf 公司）（7）恒温水浴锅（中国苏州恒瑞公司）（8）颗粒制冰机（日本 Sanyo 公司）（9） PCR 仪 2700 型（美国 ABI 公司）（10）超纯水仪（中国香港 Heal Force 公司）（11）超低温冰箱（日本 Sanyo 公司）（12）电子天平 BS-200S 型（德国 SHEIL-LAB 公司）（13）电泳仪及电泳系统（美国 Bio-Rad 公司）（14）半干转型蛋白转膜仪（日本 ATTO 公司）（15）湿转型蛋白转膜仪（美国 Bio-Rad 公司）（16）Bio-1D 图像分析软件（法国 Vilber Lourmat 公司）（17）高速低温离心机（德国 Eppendorf 公司）（18）普通台式离心机 TGL-16C 型（中国北京金龙仪器有限公司）（19）Muse 细胞计数仪（美国 Merck 公司）（20） P330 型紫外分光光度计（德国 Implen 公司）
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2 实验方法
2.1 SH-SY5Y 细胞的培养
（1）人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞培养条件：含 10%胎牛血清，2%双抗的DMEM 培养基，置温度 37℃，95% O2，5%CO2培养箱中培养。（2）当细胞密度汇合为 80%左右时，用浓度为 0.25%的胰蛋白酶消化约 1 min（倒置显微镜下观察细胞开始回缩变圆），用正常培养液终止消化后离心传代，取对数生长期生长状态良好的细胞用于实验。
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结果 ...........13
1 重组慢病毒转染 SH-SY5Y 细胞后绿色荧光的观察 ....13
2 重组慢病毒转染后细胞中 BAG-1L 蛋白的表达.............14
3 BAG-1L 过表达对缺氧处理后 SH-SY5Y 细胞活性的影响 .....14
4 BAG-1L 过表达对缺氧 8h 处理后 SH-SY5Y 细胞凋亡的影响...........15
5 缺氧 8 h 处理后 SH-SY5Y 细胞 BAG-1、HSP70、AKT mRNA 水平....16
6 缺氧 8 h 处理后 SH-SY5Y 细胞 BAG-1、HSP70 蛋白水平 ............17
7 缺氧 8 h 处理后 SH-SY5Y 细胞 AKT、p-AKT 蛋白水平.............18
讨论 ...........20
讨 论
1 SH-SY5Y 细胞及慢病毒载体的选择
人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）来源于人脑恶性肿瘤，是一种分化水平较低的肿瘤细胞。该细胞繁殖能力快，细胞形态、生理和生化功能与正常的神经细胞极为相似，因此被广泛应用于神经系统疾病发病机制、药物作用机制等方面的研究[6,7]。临床上的很多神经系统疾病都与细胞凋亡有关系，SH-SY5Y 细胞是目前研究神经细胞凋亡最常用的细胞模型[8, 9]。所以，本实验根据文献[10]选取 SH-SY5Y 细胞模拟体内神经细胞来研究缺血性脑血管病。目前外源性基因导入细胞主要有 3 种方法，即物理法、化学法和生物法。常见的物理法有电穿孔、显微注射和基因枪等；化学法包括磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法和人工脂质体法；生物法包括原生质体和病毒介导法。物理法和化学法的实验控制很严，难度较大，所以本实验选取病毒介导法。目前常用的病毒载体有腺病毒和慢病毒（Lentivirus）两种。腺病毒载体转基因效率高，不受靶细胞是否为分裂细胞的限制，但是腺病毒进入细胞后并不整合到宿主细胞的基因组中，仅瞬时表达，不适合体外长期观察某种基因的功能。慢病毒属于逆转录病毒科，是在人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）基础上发展而来的基因载体。慢病毒载体可以将外源性基因有效地整合到宿主染色体上，并且可有效转染几乎所有细胞并稳定表达。在体外实验以及体内实验研究中，慢病毒已经成为表达外源基因的常用载体形式之一，而且正在得到越来越广泛的应用。
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结 论
本研究旨在探讨重组慢病毒介导的BAG-1L基因过表达对缺氧损伤神经细胞的保护作用及其机制，采用体外培养的 SH-SY5Y 细胞代替神经细胞，模拟脑缺血缺氧性损伤。选取生长良好的人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞系，转染携带 BAG-1L基因的重组慢病毒并稳定表达，行缺氧处理；采用 CCK-8 试剂盒检测缺氧再复氧后细胞活性；Annexin Ⅴ-APC/7-AAD 双染法流式细胞仪检测细胞凋亡情况；RT-qPCR 技术检测细胞中 BAG-1 基因、HSP70 基因和 AKT 基因的 mRNA 水平；用 Western Blot 技术检测细胞中 BAG-1L, HSP70,AKT 和 p-AKT 蛋白的水平。现得出以下结论：
1.缺氧时间不同对 SH-SY5Y 细胞活性的影响也有所差异，缺氧 8 h 时对细胞的影响最为明显；外源性 BAG-1L 基因表达可减少缺氧诱导的 SH-SY5Y 细胞凋亡，对神经细胞具有保护作用。
2.外源性 BAG-1L 基因表达可上调缺氧 SH-SY5Y 细胞中 HSP70 的表达，提示BAG-1 可能与 HSP70 相互作用，从而发挥抗神经细胞凋亡作用。
3.外源性 BAG-1L 基因表达可上调 p-AKT 蛋白的水平，促进 PI3K/AKT 信号通路的激活，提示 BAG-1 可能通过促进 PI3K/AKT 信号通路的激活进而抑制缺氧导致的神经细胞凋亡。
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参考文献（略）
