第 1 章 绪 论
1.1 引言
胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，较常见的病理生理学改变为颅内压增高和广泛的脑水肿，临床表现主要有头痛、呕吐、不同程度的偏瘫、偏身感觉障碍和失语等。积极治疗胶质瘤的常用方法包括手术切除、放射治疗和化学治疗。手术切除作为最常用的治疗方法目的在于明确病理诊断、减少肿瘤细胞数量、改善患者症状从而延长患者的生存时间，但是由于恶性肿瘤呈浸润性弥漫性生长，在术中很难用肉眼区分恶性肿瘤与正常组织，所以单纯依靠手术治疗很难彻底治愈恶性肿瘤，常需要在手术治疗后进行放射治疗和化学治疗等辅助方法。目前普遍采用体外实验来测试新的抗肿瘤药物或新的联合用药方式对肿瘤细胞的抗增殖效果，这种通过细胞培养和检测细胞存活的方法被使用在多种的肿瘤细胞系中。经典的短期增殖实验被普遍应用在临床前实验中，该实验是指在加入抗肿瘤药物后观察24-72小时，并且最终需要测量的终止参数是50%抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC50）[1]。为了测量杀死全部胶质瘤的作用时间和用药浓度我们进行了长期实验，并且在长期实验中我们采用零再生浓度（regrowth concentration 0, RC0）作为终止参数[2]，RC0定义为能够杀死所有肿瘤细胞并且在移除药物后不再复发的给药浓度和用药时间。其优点是可以增加新药物应用成功率，减少新药物的花费并且增加新药物带来的收益。近年，盐霉素作为一种抗肿瘤药物不仅可以作用在多种肿瘤细胞上并且可以与其他抗肿瘤药物联合应用还具有协同作用。
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1.2 文献综述
恶性胶质瘤约占全部颅内肿瘤的50%，约占所有恶性肿瘤的2%，恶性胶质瘤的年发病率约为5/10万人。世界卫生组织（world healthorganization, WHO）根据CNS肿瘤的分化将其分为I-IV级，其中I-II属于低级别胶质瘤（low-grade gliomas, LGG），III-IV属于高级别胶质瘤（high-gradegliomas, HGG），WHO根据CNS肿瘤细胞的形态学分化将胶质瘤分为星形细胞瘤、少支胶质细胞瘤和混合性少支-星形细胞瘤等。采用手术切除、放射治疗和化学治疗方法后依然复发的HGG预后很差，III级和IV级胶质瘤的中位存活期分别为39周和30周[7]。HGG因肿瘤恶性程度高，术后容易复发，因此需要我们找到一种更为安全有效的治疗方法，尽可能阻止恶性胶质瘤的复发，延长患者生存时间。胶质瘤治疗难点在于如何彻底治愈肿瘤。单独的手术治疗往往难以根治肿瘤，尤其是恶性度高的HGG。其原因是肿瘤细胞呈浸润性弥漫性生长，在术中很难用肉眼区分恶性肿瘤与正常组织。与正常细胞的有限复制能力相比，肿瘤细胞和干细胞具有无限复制的潜能，这种特点就意味着肿瘤细胞和干细胞可以无限增殖，肿瘤干细胞（cancer stem cell, CSC）可能是肿瘤发生、复发和耐药的原因。因此我们需要在HGG术后进行放射治疗和化学治疗等辅助治疗，本篇综述将介绍几种药物治疗的新进展。通常情况下，评估新的化疗药物是否适用于肿瘤的治疗的标准途径是通过临床前测试和临床实验。用于临床前测试阶段的方法包括体内实验以及体外实验，在整个临床前测试和临床实验的过程都是非常耗时以及消耗大量科研经费的[11]。现如今普遍用体外实验来测试新的抗肿瘤药物对肿瘤细胞的抗增殖的效果，这种方法被使用在无细胞的系统中或是在细胞系中，应用比色分析方法通过短期的增殖实验来测量含氚的胸腺嘧啶脱氧核糖或溴脱氧尿苷与脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）或细胞块的结合。
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第 2 章 实验材料与方法
2.1 实验材料与方法
配备1000ml的PBS时首先准备1000ml双蒸馏水高压灭菌消毒，然后取一个1000ml的量筒加入磷酸二氢钠1.3799g和氯化钠8.766g，再将900ml双蒸馏水倒入量筒中，在磁力搅拌器的作用下充分混匀，然后在磁力搅拌器和PH测试仪的协助下将PH调成7.4，再将双蒸馏水加至1000ml。最后经过高压灭菌消毒4℃保存。在细胞衰老实验中配备2000ml的PBS, 首先准备2000ml双蒸馏水高压灭菌消毒备用，将氯化钠16.02g、氯化钾0.4025g、磷酸氢二钠2.8392g、磷酸二氢钾0.4899g融入到1800ml双蒸馏水中后在磁力搅拌器和PH测试仪的协助下将PH调成7.4，然后将双蒸馏水加至2000ml。最后经过高压灭菌消毒4℃保存。将2.8392g磷酸氢二钠溶于90ml双蒸馏水中，然后在PH测试仪的协助下将PH调成6.0。最后将双蒸馏水加至100ml配备成0.2M磷酸盐缓冲液。柠檬酸溶液与磷酸盐缓冲液混合液将上述配备好的0.1M柠檬酸溶液36.85ml和0.2M磷酸盐缓冲液63.15ml混合并将PH调整为6.0，室温下保存。先将柠檬酸溶液与磷酸盐缓冲液混合液1ml、100mM的铁氰化钾溶液0.25ml、100mM的亚铁氰化钾溶液0.25ml、25mM MgCl20.4ml、1M NaCl0.75ml和X-gal（20 mg/ml溶于DMF）混合在一起，最后将双蒸馏水加至5ml。
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2.2 方法
配备CM。首先需要在RPMI-1640培养基中加入1%HT培养基添加剂。HT是次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的混合剂，HT培养基添加剂为粉剂。打开超净工作台约20分钟后，用70%酒精消毒RPMI-1640培养基放入超净工作台。准备一次性50ml注射器一支和一个一次性针头，用70%酒精消毒后放入超净工作台中备用。将HT培养基添加剂的铝制瓶盖取下后用70%酒精消毒后放入超净工作台中。此时取出注射器吸取出5-10mlRPMI-1640培养基，装上针头插入HT培养基添加剂瓶中充分混匀后拔除针头，再用移液管取出混匀后的液体加入到RPMI-1640培养基中再次混匀，在RPMI-1640培养基瓶身上做好标记。然后再将RPMI-1640+HT与丙酮酸钠、青霉素-链霉素溶液、谷氨酰胺、胎牛血清按一定比例配备成CM。：打开超净工作台20分钟，用70%酒精消毒96孔板后，将96孔板以“+”分割为四个区域，每个区域24个孔，分别标记为左上方的甲萘醌和维生素C（M+VC）联合用药区域、右上方的甲萘醌、维生素C和0.5μM的盐霉素[M+VC+S（0.5）]联合用药区域、右下方的甲萘醌、维生素C和1.0μM的盐霉素[M+VC+S（1.0）]联合用药区域和不加入任何药物的左下方区域，左下方的区域仅在测量细胞光吸收值情况时作为校正参数使用（如图3.1）。上述3个联合用药区域中都分别由6个组组成，标记为①～⑥组，同一竖列的4个孔为一组。实验分为两组，①组为对照组、②～⑥组为实验组。
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第 3 章 结 果.........27
3.1 结果....... 27
3.1.1 短期实验的结果..... 27
3.1.2 长期实验的结果..... 35
3.1.3 衰老实验的结果..... 44
第 4 章 讨 论.........47
4.1 讨 论......... 47
4.1.1 长期实验及其终止参数的设定..... 47
4.1.2 多种抗肿瘤药物联合应用治疗胶质瘤 .... 52
4.1.3 测试细胞衰老的意义......... 57
第 5 章 结 论.........61
5.1 结 论......... 61
5.2 本研究的特色与创新 ........ 61
第 4 章 讨 论
4.1 讨 论
从短期实验结果不难看出联合用药的方式有效的阻止DBTRG-05MG和hGCL-9、hGCL-10和hGCL-12的细胞增殖情况，并且甲萘醌、维生素C和盐霉素（M+VC+S）的联合用药效果在抗肿瘤细胞的增殖方面比甲萘醌与维生素C（M+VC）联合用药效果好。在长期实验的预实验中采用单一应用0.5μM盐霉素治疗胶质瘤细胞，但是并没有杀死胶质瘤细胞。然而，采用联合应用甲萘醌、维生素C和盐霉素（M+VC+S）的方法在浓度分别为7.5μM、0.75mM、0.5μM时加药7天的实验结果显示出可以完全杀死肿瘤细胞，并且在随后的4周里观察在没有药物的细胞培养液中肿瘤没有复发。这种联合用药的方式在DBTRG-05MG和胶质瘤患者样本hGCL-9、hGCL-10和hGCL-12细胞系中有着相似的结果。但是，值得指出的是hGCL-9和hGCL-10细胞系在联合应用甲萘醌、维生素C和盐霉素，在药物浓度分别为5.0μM、0.5mM和0.5μM的较低浓度组中用药10天也可以杀死所有的胶质瘤细胞，并且在随后的4周里观察在没有药物的细胞培养液中肿瘤没有复发。因此，这种可以有效杀死所有肿瘤细胞并且在没有药物的细胞培养液中不再复发的联合用药方式具有药物浓度和用药时间依赖性。上述结果体现了4个胶质瘤细胞系对药物敏感度的差异性。根据上述实验结果建议采用长期实验方法检测药物对肿瘤细胞的作用效果，建议在未来的科研实验中适当检测减少药物剂量并且延长用药时间以检测是否具有相同的杀死肿瘤细胞的结果，这样检测可以减少药物的毒副反应对患者用药的影响。
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结论
（1）采用甲萘醌、维生素C与盐霉素联合用药可以有效的治疗胶质瘤。
（2）选用RC0作为长期实验的终止参数,可以得到杀死所有胶质瘤细胞的有效浓度和作用时间，并且进行长期实验可以观察胶质瘤复发情况。
（3）采用甲萘醌、维生素C与盐霉素联合用药的全新方式可以成功诱导胶质瘤细胞衰老，衰老的细胞失去繁殖能力，从而抑制肿瘤的生长和复发。#p#分页标题#e#
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参考文献（略）
